Die Xenotransplantation vom Schwein auf den Menschen ist mit dem Risiko der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) verbunden, die im Genom jeder Zelle des Schweins integriert sind und sich nicht durch DPF-(designated pathogen free) Zucht eliminieren lassen. PERVs infizieren humane Zellen in vitro, womit die Möglichkeit einer in vivo Infektion des humanen immunsuppremierten Rezipienten nicht ausgeschlossen werden kann. In den letzten Jahren wurde deshalb nach Möglichkeiten gesucht, die Übertragung zu verhindern. Die RNA-Interferenz stellt hierbei eine vielversprechende Strategie dar, da sie die Replikation von PERV posttranskriptional unterbinden kann. So gelang es, transgene Schweine zu generieren, die in der Lage waren, shRNAs stabil zu exprimieren.
In isolierten primären Fibroblasten der transgenen Schweine wurde das fluoreszierende GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie die Integration des Transgens mittels PCR nachgewiesen, indem zum einen das gfp-Gen und der verwendete lentivirale Vektor, als auch die Expressionskassette der shRNA detektiert wurden. Alle entnommenen primären Fibroblasten enthielten Proviren der Subtypen A, B und C, die mittels PCR nachgewiesen wurden. Zudem konnte die Expression der Volllängen-mRNA sowie gespleißter env-mRNA mittels RT-PCR gezeigt werden. Um die Sensitivität der Nachweismethoden der PERV-Expression zu erhöhen, wurde eine neue one-step RT real-time PCR unter Verwendung neuer Primer und Sonde etabliert. Dadurch konnte eine verbesserte Detektion der shRNA-induzierten Hemmung der PERV-Expression um bis zu 93 % anstelle früherer 70 % nachgewiesen werden.
Um die Effektivität der RNA-Interferenz weiter zu erhöhen, wurden neue PERV-mRNA-spezifische shRNAs generiert und mit der bisher verwendeten shRNA zu Tandems kombiniert. Nach der Klonierung der Expressionskassetten in einen retroviralen Vektor und der Transfektion in eine Verpackungszelllinie, konnten keine retroviralen Partikel nachgewiesen werden. Die Zielzellen PK15- und PERV-A/C-infizierten 293 wurden daraufhin direkt transfiziert. Die quantitative Bestimmung der PERV-Expression erfolgte molekularbiologisch mittels one-step RT real-time PCR und proteinchemisch mittels Western Blot...
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Xenotransplantation
1.1.1 Mangel an Allotransplantaten
1.1.2 Alternativen zur Allotransplantation
1.1.3 Risiken der Xenotransplantation
1.1.3.1 Immunologische Abstoßungsreaktionen
1.1.3.2 Physiologische Inkompatibilität
1.1.3.3 Potentielle Übertragung von porzinen Mikroorganismen
1.2 Retroviren
1.2.1 Taxonomie der Retroviren
1.2.2 Morphologie der Retroviren
1.2.3 Retrovirale Genomstruktur
1.2.4 Retrovirale Replikation
1.2.5 Porzine endogene Retroviren (PERVs)
1.3 RNA-Interferenz
1.4 Zielsetzung
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Bakterienstämme
2.1.2 Enzyme
2.1.3 Oligonukleotide
2.1.4 Plasmide
2.1.5 Antikörper
2.1.6 Eukaryotische Zellen
2.1.7 Versuchstiere
2.1.8 Nährmedien und Lösungen
2.1.9 Kommerzielle Kits
2.1.10 Hersteller
2.2 Methoden
2.2.1 Mikrobiologische Methoden
2.2.1.1 Stammhaltung von Bakterien
2.2.1.2 Kultivierung von Bakterien
2.2.1.3 Herstellung kompetenter Bakterien und Transformation durch Hitzeschock
2.2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.2.1 Isolierung von Plasmid-DNA
2.2.2.2 Isolierung genomischer DNA aus eukaryotischen Zellen
2.2.2.3 Phenol-Chloroform-Extraktion
2.2.2.4 Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen
2.2.2.5 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
2.2.2.6 Restriktion von DNA
2.2.2.7 Ligation von DNA-Fragmenten
2.2.2.8 Agarosegelelektrophorese
2.2.2.9 Gelextraktion linearer DNA-Fragmente
2.2.2.10 PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.2.2.11 one-step RT (Reverse Transcriptase) PCR
2.2.2.12 one-step RT (Reverse Transcriptase) real-time PCR
2.2.2.13 DNA-Sequenzierung
2.2.3 Proteinchemische Methoden
2.2.3.1 Isolierung von Gesamtprotein aus eukaryotischen Zellen
2.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
2.2.3.3 SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE)
2.2.3.4 Western Blot-Analyse
2.2.4 Zellbiologische Methoden
2.2.4.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen
2.2.4.2 Kryokonservierung eukaryotischer Zellen
2.2.4.3 Zellzählung und Vitalitätsbestimmung mit Trypanblau
2.2.4.4 Transfektion eukaryotischer Zellen mit Plasmid-DNA
3 Ergebnisse
3.1 Hemmung der PERV-Expression in Fibroblasten Pol2-shRNA-transgener Schweine
3.1.1 Generierung shRNA-transgener Schweine mittels Nukleus-Transfer
3.1.2 Nachweis der Transgen-Integration mittels Fluoreszenz
3.1.3 Nachweis der Transgen-Integration mittels PCR
3.1.4 Etablierung einer one-step RT real-time PCR zur Quantifizierung der PERV-mRNA
3.1.5 Qualitativer Nachweis von PERV in primären Fibroblasten transgener Schweine
3.1.6 Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in primären Fibroblasten transgener Schweine
3.2 Hemmung der PERV-Expression in PK15- und PERV-A/C infizierten 293-Zellen mittels neu synthetisierter shRNAs
3.2.1 Selektion eines PERV-A/C infizierten 293-Klons zur Generierung einer Zelllinie mit gleicher Provirusintegration
3.2.2 Generierung und Klonierung neuer Expressionskassetten für PERV-spezifische-shRNAs
3.2.3 Stabile Transfektion von PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen mit shRNA-Expressionskassetten
3.2.4 Nachweis der shRNA-Expressionskassetten in PK15- und PERV-A/C-infizierten 293-Zellen
3.2.5 Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in shRNA-transgenen Zellen auf Molekularebene
3.2.6 Quantitativer Nachweis der PERV-Expression in shRNA-transgenen PK15-Zellen auf Proteinebene
4 Diskussion
4.1 shRNA-spezifische Hemmung der PERV-Expression in transgenen Schweinen
4.2 Effizienzsteigerung der PERV-Expressionshemmung durch neu generierte shRNAs
5 Zusammenfassung
Zielsetzung & Forschungsthemen
Diese Diplomarbeit befasst sich mit dem Mangel an menschlichen Spenderorganen und der daraus resultierenden Bedeutung der Xenotransplantation, wobei Schweine als Spendertiere favorisiert werden. Zentrales Ziel ist die Reduktion des Risikos durch porzine endogene Retroviren (PERVs), indem deren Expression mittels RNA-Interferenz (RNAi) gehemmt wird. Dabei wird untersucht, ob sich durch neu generierte shRNAs und die Kombination zu Tandem-Kassetten eine gesteigerte Effizienz der Hemmung erreichen lässt, sowohl in primären Fibroblasten transgener Schweine als auch in infizierten 293-Zellen.
- Grundlagen der Xenotransplantation und die mit ihr verbundenen biologischen Risiken.
- Mechanismen der RNA-Interferenz als therapeutisches Instrument zur Hemmung viraler Replikation.
- Entwicklung und Etablierung sensitiver molekularbiologischer Nachweismethoden (RT-real-time PCR) zur Quantifizierung der PERV-Expression.
- Untersuchung der Wirksamkeit von shRNA-Interferenz in transgenen Modellen und Zellkulturen.
- Optimierung der Effizienz durch den Einsatz neu synthetisierter shRNAs und Expressionskassetten.
Auszug aus dem Buch
1.2.2 Morphologie der Retroviren
Infektiöse Retroviren gehören zu den RNA-Viren und haben einen Durchmesser von etwa 100 nm. Die diploide RNA ist in einem Kapsid eingeschlossen, das von einer Virushülle umgeben ist, die aus der Zytoplasmamembran der Wirtszelle abgeschnürt wurde.
In dieser Hüllmembran ist das transmembrane Hüllprotein (TM, transmembrane subunit) lokalisiert, welches mit dem viralen Glykoprotein an der Oberfläche (SU, surface subunit) nicht-kovalent verbunden ist. Diese Proteine interagieren mit den Rezeptoren der Zielzellen und werden als gemeinsames Vorläuferprotein gebildet und erst später, während der Virusmorphogenese, mit Hilfe zellulärer Proteasen gespalten.
An der Innenseite der Virusmembran sind die mit aminoterminal angefügten Myristinsäurereste verankerten Matrixproteine (MA) angeordnet. Im Inneren des Partikels ist das Viruskapsid lokalisiert, welches je nach Genus eine sphärisch-ikosaedrische oder eine konische Form aufweist und aus Kapsidproteinen (CA) zusammengesetzt ist. Dieses umschließt das retrovirale Genom, bestehend aus zwei, mit Nukleokapsidproteinen (NC) komplexierten, identischen RNA-Einzelsträngen. Die Enzyme Integrase (IN), Reverse Transkriptase (RT) und Protease (PR) sind weitere Bestandteile eines jeden Retrovirus und spielen bei dessen Replikation eine essentielle Rolle. In komplexeren Retroviren (Lentiviren, δ-Retroviren) sind zusätzlich noch akzessorische und regulatorische Proteine vorhanden.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Vermittlung des medizinischen Hintergrunds der Xenotransplantation, der Rolle von Retroviren und des Einsatzes von RNA-Interferenz als Strategie gegen PERV-Risiken.
2 Material und Methoden: Detaillierte Auflistung der verwendeten Materialien, Bakterienstämme, Enzyme und molekularbiologischen sowie zellbiologischen Verfahren zur Analyse der shRNA-Wirksamkeit.
3 Ergebnisse: Präsentation der experimentellen Resultate, angefangen bei der Charakterisierung transgener Schweine bis hin zum quantitativen Nachweis der PERV-Expressionshemmung in verschiedenen Zellmodellen.
4 Diskussion: Wissenschaftliche Einordnung und kritische Bewertung der erzielten Ergebnisse hinsichtlich der Effizienz von shRNAs und der Optimierungspotenziale für zukünftige Ansätze.
5 Zusammenfassung: Abschlussbetrachtung über das Potenzial der RNA-Interferenz, die Sicherheit bei der Nutzung porziner Organe für Transplantationen zu verbessern.
Schlüsselwörter
Xenotransplantation, Porzine endogene Retroviren, PERV, RNA-Interferenz, RNAi, shRNA, Gentherapie, Virushemmung, Retroviren, Transgene Schweine, Molekularbiologie, Molekulargenetik, Transplantationsmedizin, Genom-Integrität, Expressionsanalyse.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit beschäftigt sich mit den Risiken der Xenotransplantation, insbesondere der Übertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) vom Schwein auf den Menschen, und entwickelt Strategien mittels RNA-Interferenz, um diese Viren in transgenen Schweinen und Zellmodellen zu hemmen.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Felder umfassen die Xenotransplantation, die Biologie der Retroviren, die Funktionsweise der RNA-Interferenz sowie die praktische Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Quantifizierung von Genexpressionen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel ist die Steigerung der Hemmeffizienz der PERV-Expression durch neue, spezifisch entwickelte shRNAs und die Evaluierung dieser Hemmung sowohl in transgenen Schweine-Fibroblasten als auch in infizierten menschlichen Zelllinien.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Die Arbeit nutzt ein breites Spektrum molekularbiologischer Techniken, darunter die RNA-Interferenz (shRNA), diverse PCR-Verfahren (insbesondere one-step RT real-time PCR), Gelelektrophorese, Plasmid-Klonierung, Zellkulturtechniken und die Western-Blot-Analyse zur Proteindetektion.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Im Hauptteil werden die Generierung und Charakterisierung der transgenen Schweine, die Etablierung hochsensitiver Quantifizierungsmethoden und die Analyse der durch neue shRNAs induzierten Virushemmung in PK15- und infizierten 293-Zellen detailliert beschrieben.
Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren die Arbeit?
Die wichtigsten Begriffe sind Xenotransplantation, PERV, RNA-Interferenz, shRNA, transgene Schweine, retrovirale Vektoren und Expressionshemmung.
Warum sind PERVs ein besonderes Hindernis für die Xenotransplantation?
Im Gegensatz zu anderen Erregern, die durch spezielle DPF-Haltungsbedingungen (designated pathogen free) eliminiert werden können, sind PERVs als Proviren fest in das Genom jedes Schweins integriert und können infektiöse Partikel bilden, die potenziell humane Zellen infizieren können.
Welchen Vorteil bietet die Verwendung von shRNAs gegenüber siRNAs?
shRNAs bieten eine stabilere, dauerhafte Hemmung der Zielgenexpression, da die codierende DNA-Sequenz stabil in das Genom der Zielzellen integriert wird, während siRNAs aufgrund des schnellen Abbaus nur eine temporäre Wirkung zeigen.
Was ist die Schlussfolgerung bezüglich der Tandem-Kassetten?
Trotz der Erwartung eines additiven Effekts konnte bei den untersuchten Tandem-Kassetten keine signifikante Steigerung der Hemmung im Vergleich zu Einzelkassetten beobachtet werden, was möglicherweise auf eine sterische Hinderung bei der Transkription zurückzuführen ist.
- Quote paper
- Christoph Kruse (Author), 2009, Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/147451
