Visualization and tracking of single fluorescent molecules is a recent development in optical microscopy holding great promise for the study of cell biological processes. However, the detection and characterization of single molecules in three-dimensionally (3D) extended systems such as living cells has yet to be accomplished. By carefully choosing the hardware components of the microscope and a detailed theoretical description of the imaging process, the imaging conditions could be optimized for single molecule tracking experiments inside the cell nucleus. We developed a two-color widefield fluorescence microscope equipped with an Ar-laser and a He-Ne-laser and two CCD cameras. By programming the hardware of the CCDs we achieve a maximum frame repetition rate of 125Hz. In the first step single protein molecules of the green fluorescent protein (GFP) were detected at room-temperature in 3D-solutions with a time resolution of up to 13ms. The 2D localization precision was determined to be ~25nm. From the trajectories, the diffusion coefficients of single GFP molecules were derived and found to agree well with theoretical expectations. Using the recombinant E. coli ß-galactosidase protein P4K, single molecules could be tracked in the nuclei of 3T3-cells at a spatial accuracy of ~30nm and a time resolution of 18ms. These results suggest that proteins can move inside the nucleus over extended distances by diffusion. However, intranuclear protein diffusion is severely restricted, most likely by multiple association-dissociation events and/or impermeable obstacles. In a further step we examined the intranuclear dynamics of the splicing-factor U1-snRNP on a single molecule level. From these results we derived a model for the dynamics of U1-snRNPs. This model substantiates the view that nuclear speckles are not rigid structures but highly dynamic domains characterized by a rapid turnover of U1-snRNPs and other splicing factors.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Hintergrund und Zielsetzung
1.2 Übersicht
1.2.1 Theoretischer Teil
1.2.2 Experimenteller Teil
1.2.3 Kooperationen
1.3 Biologische Grundlagen
1.3.1 Das „Green-Fluorescent-Protein“ (GFP)
1.3.2 Das Fusionsprotein P4K
1.3.3 Der Spleißfaktor „U1 small nuclear ribonucleoprotein“ (U1-snRNP)
1.3.4 Zum Kern-Zytoplasma-Transport
2 Theoretischer Teil
2.1 Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie
2.1.1 Prinzipieller Aufbau und Bildentstehung
2.1.2 Punktübertragungsfunktion eines Weitfeld-Mikroskops
2.1.3 Auflösung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops
2.1.4 Näherung der PSF durch eine Gauß-Funktion
2.1.5 Laterale Intensitätsverteilung bei einer Defokussierung
2.2 Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle
2.2.1 Singulettsättigung
2.2.2 Triplettsättigung
2.2.3 Lichtinduziertes Bleichen
2.2.4 Anzahl der emittierten Photonen
2.3 Fluoreszenz mehrfach-markierter Proteinmoleküle
2.3.1 Sättigungsintensität und maximale Fluoreszenzrate
2.3.2 Lichtinduziertes Bleichen
2.3.3 Anzahl der emittierten Photonen
2.4 Das Signal-Rausch-Verhältnis
2.4.1 Photonenstatistik
2.4.2 Umwandlung der Fluoreszenzphotonen in ein digitales Bild
2.4.3 Definition des SRV
2.5 Das Prinzip der Nano-Lokalisierung in zwei Dimensionen
2.6 Analyse der Trajektorien einzelner Moleküle
2.6.1 Das mittlere Verschiebungsquadrat
2.6.2 Die Verteilung der Sprungdistanzen
2.6.3 Die Diffusionskonstante bei eingeschränkter Diffusion
2.6.4 Informationen über die Bewegung der Moleküle in axialer Richtung
2.6.4.1 Berechung des axialen Detektionsintervalls
2.6.4.2 Zeitliche Änderung der Molekülzahl im Detektionsintervall
2.7 Optimierung der Aufnahmeparameter
2.7.1 Das SRV in Abhängigkeit von der Belichtungszeit
2.7.2 Das SRV in Abhängigkeit von der Pixelgröße
2.7.3 Die Lokalisierungsgenauigkeit in Abhängigkeit von der Abtastrate
2.8 Abbildung zweidimensionaler Diffusionstrajektorien
2.8.1 Die Signalbreite diffundierender submikroskopischer Objekte
2.8.2 Das SRV in Abhängigkeit von der Belichtungszeit
2.8.3 Optimierung des SRV durch Variation der Anregungsintensität
2.8.4 Optimierung der Lokalisierungsgenauigkeit
3 Experimenteller Teil
3.1 Das Mikroskop
3.1.1 Die Auflösung
3.1.2 Die Detektionseffizienz
3.1.3 Der Elektronen-Konversionsfaktor
3.1.4 Das Prinzip des High-Speed-Framing (HSF)
3.1.5 Die experimentelle Lokalisierungsgenauigkeit
3.2 Zur Probenpräparation
3.2.1 Herstellung einer Probenkammer
3.2.2 Immobile Proteinmoleküle in zweidimensionalen Proben
3.2.3 Immobile Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben
3.2.4 Mobile Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben
3.2.5 Proteinmoleküle im Zellkern
3.2.6 Durchführung eines Einfarbenexperiments
3.2.7 Durchführung eines Zweifarbenexperiments
3.3 Analyse der Bilddaten
3.3.1 Bestimmung der Einzelmolekultrajektorien
3.3.2 Überlagerung der beiden Fluoreszenzkanäle
3.4 Simulation von Fluoreszenzbildern und MONTE-CARLO-Simulationen
3.4.1 Simulation von Fluoreszenzbildern
3.4.2 Simulation von Teilchentrajektorien
4 Ergebnisse
4.1 Charakterisierung der Proteinfluoreszenz
4.2 Autofluoreszenz intakter und permeabilisierter Zellen
4.3 Die zweidimensionale Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
4.3.1 Bestimmung des minimalen SRVs
4.3.2 Bestimmung des axialen Detektionsintervalls
4.3.3 Simulation zur Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
4.4 Zur Wahl der Aufnahmeparameter
4.4.1 Das Objektiv
4.4.2 Wieviele Photonen werden zur Detektion eines Moleküls benötigt?
4.4.3 Die Anregungsintensität
4.4.4 Die Belichtungszeiten
4.4.5 Welche Diffusionskonstante kann maximal gemessen werden?
4.5 Der Einzelmolekülnachweis
4.6 Abbildung einzelner GFP- und Antikörper-Moleküle in dreidimensionalen Proben
4.6.1 Nano-Lokalisierung einzelner immobiler GFP-Moleküle in PAA-Gel
4.6.2 Abbildung einzelner diffundierender GFP- und Antikörper-Moleküle
4.7 Mobilitätsmessungen an einzelnen P4K-Molekülen im Zellkern
4.7.1 Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
4.7.2 Tracking einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
4.7.3 Analyse der Trajektorien einzelner P4K-Moleküle
4.8 Analyse der Dynamik des Spleißingfaktors U1-snRNP
4.8.1 Die intranukleäre Verteilung von U1-snRNP
4.8.2 Visualisierung einzelner U1-snRNP-Partikel im Zellkern
4.8.3 Bewegung der U1-snRNPs aus dem axialen Detektionsvolumen
4.8.4 Analyse der Trajektorien einzelner U1-snRNP-Partikel
4.8.5 Bestimmung der Dissoziationsrate der U1-snRNPs von den Bindungsstellen
5 Zusammenfassung und Diskussion
5.1 Theoretischer Teil
5.2 Experimenteller Aufbau
5.3 Abbildung mobiler Moleküle in wäßrigen Lösungen
5.4 Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
5.5 Die intranukleäre Dynamik des Spleißfaktors U1-snRNP
5.5.1 Modell zur Dynamik der Spleißfaktor-Kompartimente
5.5.2 Einordnung des Modells in bisherige Ergebnisse
6 Ausblick
Zielsetzung & Themen
Diese Arbeit zielt darauf ab, neue experimentelle und theoretische Methoden zu entwickeln, die eine direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Dynamik einzelner fluoreszenzmarkierter Proteinmoleküle innerhalb des Zellkerns in lebenden Zellen ermöglichen.
- Entwicklung und Optimierung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops für Einzelmolekülmessungen in 3D-Proben.
- Theoretische Modellierung der Bildentstehung, Fluoreszenzkinetik und Diffusionsanalyse für submikroskopische Objekte.
- Implementierung von Bildverarbeitungstechniken zur Nano-Lokalisierung und Trajektorienverfolgung einzelner Partikel.
- Anwendung der Verfahren zur Untersuchung der intranukleären Dynamik von P4K-Proteinen und U1-snRNP-Spleißfaktoren.
Auszug aus dem Buch
1.1 Hintergrund und Zielsetzung
Der Zellkern enthält die genetische Information in Form großer, linearer Moleküle, der DNA. Die Umsetzung dieser Information in Proteine geschieht im Zytoplasma durch die Ribosomen. Deshalb müssen einerseits Informationsträger, insbesondere die messenger-RNA (mRNA), im Zellkern synthetisiert und in das Zytoplasma transportiert werden. Umgekehrt ist es notwendig, mRNA-synthetisierende und genregulierende Proteine, z.B. Polymerasen und Transkriptionsfaktoren, vom Zytoplasma in den Zellkern und innerhalb des Zellkerns an ihre spezifischen Wirkungsorte zu transportieren.
Lange hielt man den Zellkern in der Interphase für ein relativ homogenes, statisches Zellorganell, in dem DNA-, RNA- und Proteinmoleküle im wesentlichen zufällig verteilt sind. Dieses Bild der submikroskopischen Architektur hat sich allerdings in den letzten Jahren stark gewandelt. In vielen, überwiegend fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen erweist sich der Kern lebender Zellen als strukturell und funktionell sehr heterogen.
Gegenwärtig werden in der Zellbiologie große Anstrengungen unternommen, das Ausmaß und die Art der submikroskopischen intranukleären Organisation und die Prozesse, die sie herbeiführen und aufrechterhalten, zu verstehen. Dies erfordert u.a. das Verständnis der Synthese, des Transports und der Prozessierung von intranukleären Proteinen. Die innere Architektur des Zellkerns ist dabei eng mit den Mechanismen des intranukleären Transports von mRNA, Polymerasen und Transkriptionsfaktoren verknüpft. Andererseits kann aus der Art der intranukleären Transportvorgänge auf die submikroskopische Struktur geschlossen werden. Je nach Art der Moleküle werden freie Diffusion, eingeschränkte Diffusion in engen Interchromatinkanälen und aktiver Transport an Filamentärstrukturen, der hypothetischen Kernmatrix, diskutiert.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Diese Einleitung führt in die Komplexität der intranukleären Architektur ein und begründet die Notwendigkeit einer Methode zur Einzelmolekülvisualisierung im Kern lebender Zellen.
2 Theoretischer Teil: Hier werden die physikalischen Grundlagen der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, der Bildentstehung sowie mathematische Modelle zur Analyse von Diffusionsprozessen und Lokalisierungsgenauigkeit detailliert erläutert.
3 Experimenteller Teil: Dieses Kapitel beschreibt den technischen Aufbau des speziellen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops sowie die verwendeten Methoden zur Probenpräparation und computergestützten Bildauswertung.
4 Ergebnisse: Die Ergebnisse präsentieren die Charakterisierung der Proteinfluoreszenz und die erfolgreiche Anwendung der entwickelten Methoden zur Analyse der Mobilität von P4K-Molekülen und U1-snRNP-Spleißfaktoren im Zellkern.
5 Zusammenfassung und Diskussion: Hier werden die wesentlichen theoretischen und experimentellen Erkenntnisse zusammengeführt und die Bedeutung der entwickelten Techniken für zukünftige zellbiologische Forschung bewertet.
6 Ausblick: Der Ausblick diskutiert zukünftige Weiterentwicklungen der Mikroskopie-Methodik und des Probenmanagements, um eine noch präzisere Analyse von Bindungsstellen und Transportvorgängen im Zellkern zu erreichen.
Schlüsselwörter
Einzelmolekülmikroskopie, Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Zellkern, Intranukleärer Transport, Proteindynamik, U1-snRNP, Spleißfaktor, P4K, Diffusion, Nanolokalisierung, Signal-Rausch-Verhältnis, Bildsimulation, Photobleichung, Trajektorienanalyse, Speckles
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Dissertation im Kern?
Die Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Anwendung von fluoreszenzmikroskopischen Methoden zur direkten Beobachtung und quantitativen Analyse einzelner Proteinmoleküle in der dreidimensionalen Struktur des Zellkerns lebender Zellen.
Welche wissenschaftliche Methode wird primär eingesetzt?
Zum Einsatz kommt die hochauflösende Auflicht-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, ergänzt durch digitale Bildverarbeitung für die Nano-Lokalisierung und statistische Trajektorienanalysen wie das mittlere Verschiebungsquadrat (MSD) und die Sprungdistanzverteilung.
Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?
Zentral sind die Untersuchung der Proteindynamik im Zellkern, die biophysikalische Charakterisierung von Transportvorgängen sowie die Optimierung von Messparametern für eine präzise Lokalisierung unter Berücksichtigung von Photobleichung und Hintergrundsignalen.
Welche biologischen Modelle wurden für die Analysen verwendet?
Als Modellsysteme dienten unter anderem das Green-Fluorescent-Protein (GFP), das inerte Fusionsprotein P4K zur Sondenanalyse und der Spleißfaktor U1-snRNP zur Untersuchung intranukleärer Prozesse.
Was ist das primäre Forschungsziel?
Das Ziel ist es, molekulare Prozesse im Zellkern (wie die Dynamik von Spleißfaktoren) auf Ebene einzelner Moleküle in vivo zu visualisieren und deren Mobilitätsklassen quantitativ zu unterscheiden.
Welche Rolle spielt die Bildsimulation?
Die Simulation von Fluoreszenzbildern und Teilchentrajektorien dient dazu, komplexe experimentelle Einflüsse (wie Rauschen oder begrenzte Lebensdauer durch Photolyse) besser zu verstehen und die experimentellen Aufnahmeparameter systematisch zu optimieren.
Wie unterscheidet sich diese Arbeit von FRAP-Messungen?
Im Gegensatz zu FRAP-Messungen, die eine Mittelung über Ensembles von Molekülen vornehmen, ermöglicht die Einzelmoleküldetektion die Unterscheidung verschiedener Mobilitätsfraktionen und die Analyse individueller Bewegungsmodi innerhalb einer Probe.
Warum sind die untersuchten Spleißfaktor-Kompartimente (Speckles) von Interesse?
Speckles stellen hochdynamische Regionen dar. Die Untersuchung ihrer Beteiligung am Spleißprozess durch die Analyse der U1-snRNP-Partikel gibt Aufschluss darüber, ob diese Strukturen eher statische Speicher oder dynamische Umschlagplätze für Spleißvorgänge sind.
Was ist das Ergebnis zur Dynamik der U1-snRNP-Partikel?
Es konnte gezeigt werden, dass die U1-snRNPs in Speckles einer stark eingeschränkten Diffusion unterliegen und in einem kontinuierlichen Austauschprozess mit dem Nukleoplasma stehen, wobei passive Diffusion durch Bindungsprozesse dominiert wird.
- Citar trabajo
- Thorsten Kues (Autor), 2001, Visualisierung einzelner Proteinmoleküle und Analyse ihrer Trajektorien in intakten Zellkernen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/178967
