Visualisierung einzelner Proteinmoleküle und Analyse ihrer Trajektorien in intakten Zellkernen mittels Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Hintergrund und Zielsetzung
1.2 Ubersicht
1.2.1 Theoretischer Teil
1.2.2 Experimenteller Teil
1.2.3 Kooperationen
1.3 Biologische Grundlagen
1.3.1 Das ”Green-Fluorescent-Protein“ (GFP)
1.3.2 Das Fusionsprotein P4K
1.3.3 Der Spleißfaktor ”U1 small nuclear ribonucleoprotein“ (U1-snRNP)
1.3.4 Zum Kern-Zytoplasma-Transport

2 Theoretischer Teil
2.1 Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie
2.1.1 Prinzipieller Aufbau und Bildentstehung
2.1.2 Punktübertragungsfunktion eines Weitfeld-Mikroskops
2.1.3 Auflösung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops
2.1.4 Näherung der PSF durch eine Gauß-Funktion
2.1.5 Laterale Intensitatsverteilung bei einer Defokussierung
2.2 Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle
2.2.1 Singulettsattigung
2.2.2 Triplettsattigung
2.2.3 Lichtinduziertes Bleichen
2.2.4 Anzahl der emittierten Photonen
2.3 Fluoreszenz mehrfach-markierter Proteinmoleküle
2.3.1 Sattigungsintensitat und maximale Fluoreszenzrate
2.3.2 Lichtinduziertes Bleichen
2.3.3 Anzahl der emittierten Photonen
2.4 Das Signal-Rausch-Verhältnis
2.4.1 Photonenstatistik
2.4.2 Umwandlung der Fluoreszenzphotonen in ein digitales Bild
2.4.3 Definition des SRV
2.5 Das Prinzip der Nano-Lokalisierung in zwei Dimensionen
2.6 Analyse der Trajektorien einzelner Moleküle
2.6.1 Das mittlere Verschiebungsquadrat
2.6.2 Die Verteilung der Sprungdistanzen
2.6.3 Die Diffusionskonstante bei eingeschrankter Diffusion
2.6.4 Informationen über die Bewegung der Moleküle in axialer Richtung . . . .
2.6.4.1 Berechung des axialen Detektionsintervalls
2.6.4.2 Zeitliche ¨Anderung der Molekülzahl im Detektionsintervall . . .
2.7 Optimierung der Aufnahmeparameter
2.7.1 Das SRV in Abhangigkeit von der Belichtungszeit
2.7.2 Das SRV in Abhangigkeit von der Pixelgröße
2.7.3 Die Lokalisierungsgenauigkeit in Abhangigkeit von der Abtastrate . . . .
2.8 Abbildung zweidimensionaler Diffusionstrajektorien
2.8.1 Die Signalbreite diffundierender submikroskopischer Objekte
2.8.2 Das SRV in Abhangigkeit von der Belichtungszeit
2.8.3 Optimierung des SRV durch Variation der Anregungsintensitat
2.8.4 Optimierung der Lokalisierungsgenauigkeit

3 Experimenteller Teil
3.1 Das Mikroskop
3.1.1 Die Auflösung
3.1.2 Die Detektionseffizienz
3.1.3 Der Elektronen-Konversionsfaktor
3.1.4 Das Prinzip des High-Speed-Framing (HSF)
3.1.5 Die experimentelle Lokalisierungsgenauigkeit
3.2 Zur Probenpraparation
3.2.1 Herstellung einer Probenkammer
3.2.2 Immobile Proteinmoleküle in zweidimensionalen Proben
3.2.3 Immobile Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben
3.2.4 Mobile Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben
3.2.5 Proteinmoleküle im Zellkern
3.2.6 Durchführung eines Einfarbenexperiments
3.2.7 Durchführung eines Zweifarbenexperiments
3.3 Analyse der Bilddaten
3.3.1 Bestimmung der Einzelmolekültrajektorien
3.3.2 ¨Uberlagerung der beiden Fluoreszenzkanäle
3.4 Simulation von Fluoreszenzbildern und MONTE-CARLO-Simulationen
3.4.1 Simulation von Fluoreszenzbildern
3.4.2 Simulation von Teilchentrajektorien

4 Ergebnisse
4.1 Charakterisierung der Proteinfluoreszenz
4.2 Autofluoreszenz intakter und permeabilisierter Zellen
4.3 Die zweidimensionale Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
4.3.1 Bestimmung des minimalen SRVs
4.3.2 Bestimmung des axialen Detektionsintervalls
4.3.3 Simulation zur Abbildung dreidimensionaler Trajektorien
4.4 Zur Wahl der Aufnahmeparameter
4.4.1 Das Objektiv
4.4.2 Wieviele Photonen werden zur Detektion eines Moleküls benötigt?
4.4.3 Die Anregungsintensitat
4.4.4 Die Belichtungszeiten
4.4.5 Welche Diffusionskonstante kann maximal gemessen werden?
4.5 Der Einzelmolekülnachweis
4.6 Abbildung einzelner GFP- und Antikörper-Moleküle in dreidimensionalen Proben
4.6.1 Nano-Lokalisierung einzelner immobiler GFP-Moleküle in PAA-Gel
4.6.2 Abbildung einzelner diffundierender GFP-und Antikörper-Moleküle
4.7 Mobilitatsmessungen an einzelnen P4K-Molekülen im Zellkern
4.7.1 Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
4.7.2 Tracking einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
4.7.3 Analyse der Trajektorien einzelner P4K-Moleküle
4.8 Analyse der Dynamik des Spleißingfaktors U1-snRNP
4.8.1 Die intranukleare Verteilung von U1-snRNP
4.8.2 Visualisierung einzelner U1-snRNP-Partikel im Zellkern
4.8.3 Bewegung der U1-snRNPs aus dem axialen Detektionsvolumen
4.8.4 Analyse der Trajektorien einzelner U1-snRNP-Partikel
4.8.5 Bestimmung der Dissoziationsrate der U1-snRNPs von den Bindungsstellen

5 Zusammenfassung und Diskussion
5.1 Theoretischer Teil
5.2 Experimenteller Aufbau
5.3 Abbildung mobiler Moleküle in waßrigen Lösungen
5.4 Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
5.5 Die intranukleare Dynamik des Spleißfaktors U1-snRNP
5.5.1 Modell zur Dynamik der Spleißfaktor-Kompartimente
5.5.2 Einordnung des Modells in bisherige Ergebnisse

6 Ausblick

A Verwendete Abkürzungen und Symbole

B Liste wissenschaftlicher Beitrâge
B.1 Publikationen
B.2 Konferenzbeitrage und publizierte Abstracts
B.3 Vortrage

Literaturverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

1.1 Beispiele für die Kompartimentierung des Zellkerns
1.2 Struktur eines GFP-Moleküls
1.3 Schema einer Intronsequenz
1.4 Struktur eines U1-snRNP-Partikels
1.5 Darstellung des Spleißprozesses; Verteilung von Spleißfaktoren im Zellkern

2.1 Prinzipieller Aufbau eines Weitfeld-Mikroskops
2.2 Bildentstehung im Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop
2.3 Punktübertagungsfunktion eines Weitfeld-Mikroskops
2.4 Laterales und axiales Profil der Punktübertragungsfunktion
2.5 Gauß-Fit an die laterale Punktübertragungsfunktion
2.6 Die Punktübertragungsfunktion bei Defokussierung
2.7 Laterale Breite der Punktübertragungsfunktion bei Defokussierung
2.8 Energie-Term-Schema eines Fluoreszenzmoleküls im Vier-Niveau-Modell
2.9 Zur Fluoreszenzsaettigung
2.10 Schema einer Molekültrajektorie
2.11 Zur Herleitung der Sprungdistanzverteilung
2.12 Beispiele für Sprungdistanzverteilungen
2.13 Zeitliche Entwicklung einer Sprungdistanzverteilung
2.14 Konzentrationsverteilung der Moleküle im Detektionsintervall
2.15 Anzahl der Moleküle im Detektionsintervall in Abhängigkeit von der Zeit
2.16 Signal-Rausch-Verhältnis in Abhängigkeit von der Belichtungszeit
2.17 Signal-Rausch-Verhältnis in Abhängigkeit von der Pixelgröße
2.18 Lokalisierungsgenauigkeit in Abhängigkeit von der Abtastrate
2.19 Die Form des Signals eines diffundierenden Moleküls
2.20 Signalbreite bei zweidimensionaler Diffusion
2.21 Das Signal-Rausch-Verhältnis in Abhängigkeit von der Belichtungszeit
2.22 Das SRV in Abhängigkeit von der Belichtungszeit und der Anregungsintensität
2.23 Die Lokalisierungsgenauigkeit in Abhängigkeit von der Belichtungszeit

3.1 Der experimentelle Aufbau
3.2 Das Mikroskopstativ im Detail
3.3 Zur Messung des Photoelektronen-Konversionsfaktors
3.4 Schematische Darstellung des HSF-Prinzips
3.5 Beispiel eines ICL-Skripts
3.6 Die experimentelle Lokalisierungsgenauigkeit
3.7 Benutzeroberfläche der Bildverarbeitungssoftware

4.1 Messung der Fluoreszenz einzelner Proteinmoleküle
4.2 Analyse der Autofluoreszenz
4.3 Bildsimulation zur Bestimmung des minimalen SRV
4.4 Ergebnisse der Monte-Carlo-Simulation
4.5 GFP-Moleküle in PAA-Gel
4.6 Diffusion eines GFP-Moleküls in 80% Glyzerin
4.7 Zeitliche Abhängigkeit des MSD einzelner GFP-Moleküle in Glyzerin
4.8 Visualisierung einzelner P4K-Moleküle im Zellkern
4.9 Unterschiedliche Bewegungsklassen der P4K-Moleküle im Zellkern
4.10 Sprungdistanzverteilungen der P4K-Moleküle im Zellkern
4.11 Diffusionskonstanten der P4K-Moleküle in Abhängigkeit von der Zeit
4.12 Verteilung von U1-snRNP im Zellkern
4.13 Visualisierung einzelner U1 snRNPs im Zellkern
4.14 U1-snRNP-Cluster im Zellkern
4.15 Bewegung der U1-snRNP-Partikel aus dem Detektionsvolumen
4.16 Sprungdistanzverteilungen der U1-snRNP-Partikel im Zellkern
4.17 Zeitabhängige Diffusionskonstanten und MSD der U1-snRNPs im Zellkern
4.18 Die zeitliche Entwicklung der immobilen Fraktion

5.1 Modell der U1-snRNP-Dynamik im Zellkern
5.2 Modell zur intranukleären Proteindynamik

6.1 Ultrahochaufl¨osung durch Einzelmoleküldetektion in vivo

Tabellenverzeichnis

2.1 Ergebnisse der numerischen Berechnung der Signalbreite mobiler Moleküle

3.1 Auflösung des Mikroskops
3.2 Transmissionsgrade der optischen Komponenten
3.3 Elektronen-Konversionsfaktoren der Kameras

4.1 Fluoreszenzdaten der Farbstoffe und fluoreszenzmarkierter Proteine
4.2 Diffusionskonstanten von GFPund Antikörper-Molekü333len in Glyzerin
4.3 Diffusionskonstanten von P4K-Molekülen im Zellkern
4.4 Transportkoeffizienten und Zeitexponenten der P4K-Mobilitätsanalyse
4.5 Diffusionskonstanten von U1-snRNP-Partikel im Zellkern
4.6 Transportkoeffizienten und Zeitexponenten der U1-Mobilitätsanalyse

1 Einleitung

1.1 Hintergrund und Zielsetzung

Der Zellkern enthält die genetische Information in Form großer, linearer Moleküle, der DNA. Die Umsetzung dieser Information in Proteine geschieht im Zytoplasma durch die Ribosomen. Deshalb müssen einerseits Informationsträger, insbesondere die messenger-RNA (mRNA), im Zellkern synthetisiert und in das Zytoplasma transportiert werden. Umgekehrt ist es notwendig, mRNA-synthetisierende und genregulierende Proteine, z.B. Polymerasen und Transkriptionsfaktoren, vom Zytoplasma in den Zellkern und innerhalb des Zellkerns an ihre spezifischen Wirkungsorte zu transportieren.

Lange hielt man den Zellkern in der Interphase für ein relativ homogenes, statisches Zellorganell, in dem DNA-, RNAund Proteinmoleküle im wesentlichen zufällig verteilt sind. Dieses Bild der submikroskopischen Architektur hat sich allerdings in den letzten Jahren stark gewandelt. In vielen, überwiegend fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen erweist sich der Kern lebender Zellen als strukturell und funktionell sehr heterogen. Die DNA nimmt z.B. in Form von Chromosomen definierte Territorien ein [Crem01], und eine Vielzahl von Proteinen ist vorzugsweise in definierten intranukleären Kompartimenten lokalisiert, wie dem Nukleolus, den Spleißfaktor-Kompartimenten und einer Vielzahl kleiner nukleärer Foki (vgl. Abb.1.1). Mit Ausnahme des Nukleolus, in dem die ribosomale RNA transkribiert wird, sind die Funktionen und der genaue Aufbau dieser Kompartimente noch weitgehend unbekannt. Das Vorhandensein dieser zahlreichen Kompartimente läßt darauf schließen, daß spezifische Prozesse an speziellen Orten im Kern stattfinden.

Gegenwärtig werden in der Zellbiologie große Anstrengungen unternommen, das Ausmaß und die Art der submikroskopischen intranukleären Organisation und die Prozesse, die sie herbeiführen und aufrechterhal- ten, zu verstehen. Dies erfordert u.a. das Verständnis der Synthese, des Transports und der Prozessie- mRNA, Polymerasen und Transkriptionsfaktoren verknüpft. Andererseits kann aus der Art der intranukleären Transportvorgänge auf die submikroskopische Struktur geschlossen werden. Je nach Art der Moleküle werden freie Diffusion, eingeschränkte Diffusion in engen Interchromatinkanälen und aktiver Transport an Filamentärstrukturen, der hypothetischen Kernmatrix, diskutiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.1: Beipiele für die funktionelle Kompartimentierung des Zellkerns (A) Nukleoli (magenta), (B) rung von intranukleären Proteinen [Mist01][Pede01]. (gelb), ”CajalBodies“ (C) Spleißfaktor-Kompartimente. Die innere Architektur des Zellkerns ist dabei eng mit Intranukleäre Substrukturen sind nicht den Mechanismen des intranukleären Transports von durch eine Membran abgegrenzt [Mist00].

Die rasante Entwicklung nicht-invasiver, fluoreszenzmikroskopischer Methoden der letzten Jahre ermöglichte der zellbiologischen Forschung neue Einblicke. Insbesondere die erfolgreiche Anwendung von Fluoreszenz-Mikrophotolysetechniken ( FRAP und ”FluorescenceRecoveryafterPhotobleaching“, ”FluorescenceLossinPhotobleaching“,FLIP)ermöglichenmittlerweilenichtnur die reine Abbildung der Proteindynamik in vivo, sondern in Verbindung mit entsprechenden kinetischen Modellen können biophysikalische Eigenschaften der Proteine quantitativ bestimmt werden, z.B. Assoziationsund/oder Dissoziationsraten und Bindungskonstanten [Mist01]. Die Mehrzahl der zahlreichen Veröffentlichungen zur Proteindynamik im Zellkern basieren ausschließlich auf diesen Methoden. Eine Übersicht findet sich in [Pede01].

Ein entscheidender Nachteil von FRAP und FLIP besteht allerdings darin, daß es sich bei diesen Methoden um Ensemblemessungen handelt, d.h. die gemessene Kinetik mittelt automatisch über eine Vielzahl von Proteinmolekülen ohne Berücksichtigung eventuell vorhandener Subpopulationen. Unterschiedliche Bewegungsmodi, wie z.B. passive Diffusion und aktiver Transport, können somit nicht voneinander getrennt detektiert werden. Abgesehen von immobilen Molekülen sind auch unterschiedliche Klassen innerhalb eines Bewegungsmodus nicht meßbar. Existiert ein Protein z.B. in einer komplexierten und einer freien Form, so ergeben sich aufgrund der Molekülgröße zwei verschiedene Diffusionskonstanten, die sich allerdings einer FRAPoder FLIP-Messung durch die implizite Mittelung entziehen. Die relativ geringe räumliche Auflösung der Mikrophotolysetechniken (lateral [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 1 μ m, axial ≫ 1 μ m) begrenzt deren Anwendungsmöglichkeiten, weil die Ausdehnung zahlreicher intranukleärer Strukturen, z.B. die Spleißfaktor-Kompartimente, im Bereich von ≤ 1 μ m liegen. Zur direkten Visualisierung und Analyse molekularer Prozesse, die häufig auf einer Skala von wenigen Nanometern ablaufen, wie z.B. der Vorgang des mRNASpleißens, sind diese Methoden somit nicht gut geeignet.

Es ist daher wünschenswert, die Mikrophotolysetechniken durch eine entsprechende Methode zu ergänzen, um diese Nachteile auszugleichen. Zudem könnten dann die bisherigen Ergebnisse, die überwiegend auf diesen Techniken basieren, überprüft werden. Das Gegenstück zu einer Ensemblemessung ist die Analyse der Dynamik an einzelnen Teilchen. Dies erfordert im konkreten Fall die direkte Visualisierung einzelner Proteinmoleküle und die räumliche und zeitliche Auflösung ihrer Bewegung im Kern lebender Zellen.

Zur optischen Detektion einzelner Moleküle wurden bislang unterschiedliche Verfahren entwickelt, die sowohl im Tiefals auch im Raumtemperaturbereich zahlreiche Anwendungen finden [Nie97][Hara98][Moer99][Basc97]. Eine wichtige Voraussetzung ist dabei die Reduktion von Hintergrundsignalen. Dies wird in der Regel durch eine effektive Verringerung des Probenvolumens erzielt, z.B. durch totale interne Reflexion, Nahfeldbeleuchtung, multi-Photonenoder konfokale Abbildung. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Messungen auf relativ dünne zweidimensionale Systeme, wie z.B. Glas/Wasser-Grenzschichten, Lipid-Bilayer und Zelloberflächen zu beschränken [Sase95][Schm95][Xu97]. Dadurch konnte die Einzelmolekültechnik z.B. dazu verwendet werden, die laterale Mobilität einzelner Rezeptorund Lipidmoleküle in Zell- membranen zu messen [Gosh94][Schü97][Smit99], die Bewegung einzelner Myosinmoleküle zu beobachten [Vale96][Kita99] oder Konformationsänderungen einzelner DNA-Moleküle zu analysieren [Perk94].

Im Gegensatz zu diesen Untersuchungen an zweidimensionalen biologischen Systemen erfordert die Analyse dynamischer Prozesse im Innern des Zellkerns die Abbildung einzelner mobiler Moleküle die sich in dreidimensionalen Proben bewegen. Die typische axiale Ausdehnung eines Zellkerns beträgt ca. 10 μ m und liegt damit um 1-2 Größenordnungen über den bisher untersuchten Systemen. Bislang gab es keine Möglichkeit, molekulare Prozesse in dreidimensional ausgedehnten Proben, wie dem Zellkern, in vivo auf der Ebene einzelner Moleküle zu beobachten.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist daher zunächst die Entwicklung der theoretischen und experimentellen Methoden, die eine direkte Visualisierung und Analyse molekularer Prozesse anhand einzelner Proteinmoleküle im Zellkern ermöglichen. Anschließend soll das Verfahren der Einzelmoleküldetektion auf die Analyse der intranukleären Dynamik des Fusionsproteins P4K und des Spleißfaktors U1-snRNP erfolgen.

1.2 Übersicht

Die in dieser Arbeit entwickelten fluoreszenzmikroskopischen Techniken ermöglichen die Visualisierung einzelner fluoreszenzmarkierter Proteinmoleküle im Zellkern und die Analyse ihrer Dynamik anhand der beobachteten Trajektorien.

Bei der Konstruktion des Mikroskops wurde vor allem auf eine hohe Detektionseffizienz und Zeitauflösung Wert gelegt, ohne die speziellen Eigenschaften der Probe zu vernachlässigen. So muß insbesondere berücksichtigt werden, daß Zellkerne eine dreidimensionale Struktur aufweisen und die Bewegung der Proteinmoleküle demnach prinzipiell in drei Dimensionen erfolgen kann. Die Fluoreszenzanregung muß somit im Zellinnern erfolgen können und darf nicht auf die Oberfläche der Zellen oder auf die Grenzschicht am Deckglas begrenzt sein, wie z.B. in der optischen Nahfeldmikroskopie. Die punktförmige Beleuchtung und Detektion des emittierten Lichts durch das Abrastern mit einem beugungsbegrenzten Laserspot, wie z.B. in einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM), kommen aufgrund der relativ langen Bildaufnahmezeiten nicht in Frage. Der realisierte Aufbau basiert daher auf dem relativ einfachen Prinzip eines Auflicht-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops. Ein aufgeweiteter, kontinuierlicher Laserstrahl hoher Intensität dient zur Fluoreszenzanregung und die Detektion des emittierten Lichts erfolgt mit CCD-Kameras. Das Mikroskop ermöglicht die simultane Anregung (488 nm und 633 nm) und Detektion zweier Fluoreszenzfarbstoffe, so daß prinzipiell die Beobachtung der Wechselwirkung zweier unterschiedlicher Proteine auf molekularer Ebene möglich ist.

1.2.1 Theoretischer Teil

Zunächst werden die Prinzipien vorgestellt, die der Entstehung und Optimierung fluoreszenzmikroskopischer Bilder von immobilen und mobilen, fluoreszierenden Proteinmolekülen zugrunde liegen. Ausgehend von der Abbildung immobiler submikroskopischer Objekte werden zunächst grundlegende Begriffe wie die Punktabbildungsfunktion (PSF), Auflösung, Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) und Lokalisierungsgenauigkeit definiert. Anschließend wird die Fluoreszenzund Photolysekinetik von Farbstoffen und deren Abhängigkeit von der Anregungsintensität und Belichtungszeit anhand eines Vier-Niveau-Modells hergeleitet. Zusammen mit der Beschreibung der Umwandlung des Fluoreszenzlichts in ein digitales Bild, ermöglichen diese Ergebnisse, die grundlegenden Parameter der Bildentstehung, wie z.B. die Vergrößerung des Objektivs und die Pixelgröße des Detektors, optimal aufeinander abzustimmen, um z.B das SRV der Signale zu maximieren. Da das Ziel die Abbildung mobiler Proteinmoleküle ist, wurden darüberhinaus die Effekte, die sich aus der Bewegung der Moleküle während der Bildaufnahme ergeben, theoretisch analysiert. Dies betrifft insbesondere die Breite der PSF in Abhängigkeit von der Belichtungszeit und der Diffusionskonstanten. Die Ergebnisse ermöglichen nicht nur die theoretische Abschätzung der experimentell notwendigen Belichtungszeiten und Anregungsintensitäten, sondern auch die Optimierung dieser Aufnahmeparameter im Hinblick auf eine bessere Sichtbarkeit und Lokalisierungsgenauigkeit der mobilen Proteinmoleküle.

Anschließend werden die theoretischen Methoden eingeführt, mit denen die Dynamik der Proteinmoleküle anhand der detektierten Trajektorien analysiert werden können. Die Abbildung der dreidimensionalen Bewegung einzelner Proteinmoleküle mit einer CCD-Kamera ist eine zweidimensionale Projektion der Trajektorie und es stellt sich die Frage, welche Informationen sich aus den zweidimensionalen Daten gewinnen lassen und wie diese zu analysieren und zu interpretieren sind. Ausgehend von der einfachen Bestimmung des mittleren Abstandsquadrats zur Messung der Diffusionskonstanten bei freier Diffusion, wird die Sprungdistanzanalyse vorgestellt. Diese ermöglicht eine getrennte Messung unterschiedlicher Diffusionsgeschwindigkeiten innerhalb eines Ensembles von Molekülen. Darüberhinaus wird die zeitabhängige Diffusionskonstante eingeführt, die sich insbesondere zur Beschreibung von eingeschränkter Diffusion eignet.

1.2.2 Experimenteller Teil

Zunächst wird die Autofluoreszenz der Zellen und die Fluoreszenzintensität der verwendeten Probenmoleküle näher untersucht. Zusammen mit den Ergebnissen der theoretischenÜberlegungen werden dann die experimentellen Parameter für die Abbildung einzelner Moleküle abgeschätzt. Im ersten wichtigen Schritt wird anhand von Modellproben gezeigt, daß der experimentelle Aufbau erstmalig die Visualisierung einzelner, frei diffundierender Proteinmoleküle in dreidimensionalen Proben in Tiefen bis zu 15 μ m ermöglicht [Kubi00]. Die Messung der Diffusionskonstanten anhand der Trajektorienanalyse einzelner Proteinmoleküle belegt, daß deren Mobilität nicht nur beobachtet, sondern auch quantitativ analysiert werden kann.

Im fundamentalen zweiten Schritt werden einzelne P4K-Moleküle im Zellkern abgebildet, die signalvermittelt in den Kern permeabilisierter Zellen importiert wurden. Auf diese Weise konnte erstmalig die intranukleäre Dynamik eines Proteins auf der Ebene einzelner Moleküle direkt beobachtet und analysiert werden [Kues01a].

In einem weiteren Schritt erfolgt dann die Anwendung der entwickelten Methoden auf die Untersuchung der Dynamik des Spleißfaktors U1-snRNP im Zellkern. Die U1-snRNP-Partikel sind am fundamentalen zellbiologischen Prozeß des mRNA-Spleißens beteiligt. Anhand der Ergebnisse dieser Messungen wird ein Modell entwickelt, das die Mobilität der U1-snRNPs und die beobachtete Dynamik der Spleißfaktor-Kompartimente beschreibt [Kues01b].

1.2.3 Kooperationen

Während der dreijährigen experimentellen Arbeit an meiner Promotion entstanden zwei Diplomarbeiten, deren Anfertigung u.a. auch von mir betreut wurde. Teile dieser Arbeiten, insbesondere die Messungen am GFP, finden sich aufgrund der Vollständigkeit undÜbersicht auch in dieser Niederschrift. Entsprechende Stellen sind mit einem Verweis auf die Diplomarbeiten gekennzeichnet. Es handelt sich um die Arbeiten ”VisualisierungeinzelnerMoleküledes ’Green Fluorescent Protein‘ und Analyse ihrer Diffusionstrajektorien in wäßrigen Medien“ von Oliver Kückmann [Kück99] und ”LokalisierungeinzelnerProteinmoleküleimInnerenvoneukaryonten Zellen mittels Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie“ von Daniel Rohleder [Rohl01].

Die Messungen am Spleißfaktor U1-snRNP erfolgten in Zusammenarbeit mit Dr. Achim Dickmanns vom Max-Planck-Institut für Biochemie, RNA-Metabolismus und Neuronalen Krankheiten in Martinsried und Prof. Dr. Reinhard Lührmann vom Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie in Göttingen.

Das Plasmid zur Expression der hier verwendeten GFP-Mutante S65G/S72A/T203F wurde freundlicherweise von Prof. R.Y. Tsien zur Verfügung gestellt.

1.3 Biologische Grundlagen

Die Einzelmolekülexperimente im Rahmen dieser Arbeit erfolgten an drei unterschiedlichen Proteinen. Zum besseren Verständnis der durchgeführten Messungen und Resultate werden daher im folgenden Abschnitt die Eigenschaften dieser Proteine näher beschrieben, insbesondere die zellbiologisch bedeutende Funktion des Spleißfaktors U1-snRNP.

1.3.1 Das ”Green-Fluorescent-Protein“(GFP)

Die ersten Einzelmolekülmessungen in dreidimensionalen Proben erfolgten an einem Modellsystem. Diese Proben bestanden aus wäßrigen Glyzerinlösungen in denen in sehr geringer Konzentration einzelne Moleküle des GFP-Proteins verdünnt waren. Das natürlich vorkommende GFP findet mittlerweile in der Fluoreszenzmikroskopie zahlreiche Anwendungen [Tsie98][Harm01]. Durch die molekularbiologische Konstruktion eines Fusionsproteins mit GFP bietet sich z.B. die faszinierende Möglichkeit, Strukturen in der Zelle in vivo mit einem Fluoreszenzmarker zu versehen.

Das GFP basiert auf dem autofluoreszierenden Protein der Quallenart Aequorea Victoria. In Abbildung 1.2 ist die Struktur eines GFP-Proteins gezeigt. Es besteht aus 238 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von insgesamt 30 kDa. Der Chromophor im

Innern der zylindrischen Struktur ist von elf β -Faltblattstrukturen umgeben. Der Durchmesser des Zylinders beträgt ca. 2 , 8 nm und ist ca. 4 nm hoch [Yang96][Ormö96]. Einzelheiten zur Expression und Aufreinigung finden sich in [Kubi00].

Abbildung 1.2: Struk- tur eines GFP-Moleküls [Jond96].

1.3.2 Das Fusionsprotein P4K

Das Protein P4K wurde in den Einzelmolekülexperimenten im Zellkern als eine Art passive ”Son- de“ eingesetzt. Es ist ein hydrophiles, bakterieelles Enzym und besitzt daher keinerlei Funktion in eukaryotischen Zellen und verhält sich im Zellkern vermutlich inert. Der Stoffwechsel der eukaryotischen Wirtszelle sollte daher nicht beeinträchtigt werden. Das Fusionsprotein P[4]K besteht im wesentlichen aus dem Enzym β -Galaktosidase des Bakteriums Escherichia Coli und liegt in der Regel als Tetramer mit einer Größe von 17 , 5 × 13 , 5 × 9 nm [3] vor [Jaco94]. An den Amino-Terminus der β -Galaktosidase ist die Kernlokalisationssequenz (NLS) des SV-40Antigens fusioniert, um den aktiven Transport durch die Kernporenkomplexe in den Kern zu ermöglichen. Die Expression dieses Hybrid-Proteins erfolgte in Escherichia Coli und wurde mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt [Rhis89]. Die P4K-Moleküle wurden anschließend mit dem Farbstoff Alexa[488] markiert [Kues01a].

1.3.3 Der Spleißfaktor ”U[1]smallnuclearribonucleoprotein“(U[1]-snRNP)

Die experimentellen Techniken und Erfahrungen, die in den zahlreichen Messungen an GFPund P4K-Molekülen gewonnen wurden, konnten erfolgreich auf die Analyse der Dynamik des Spleißfaktors U1-snRNP im Zellkern angewendet werden. Die Funktion und Struktur der am fundamentalen Prozeß des Spleißens beteilgten U1-snRNP-Partikel werden im folgenden näher erläutert.

Voraussetzung für die Biosynthese eines Proteins in eukaryotischen Zellen ist die ÜbertragungderimZellkern in der DNA gespeicherten Informationen an den Ort der Proteinbiosynthese, die in den Ribosomen im Zytoplasma stattfindet. Dazu wird die genetische Information der DNA in eine entsprechende Basensequenz transkribiert, der sogenannten messenger-RNA (mRNA). Diese trägt die Informationen für die Synthese eines oder mehrerer Proteine. Bei der Synthese der mRNA entsteht zunächst eine Vorstufe der mRNA, die sogenannte pre-mRNA. Diese enthält Introns, die keine Information für die Proteinsynthese tragen, und Exons, die das eigentliche Protein codieren, als Kopie in gleicher Anordnung wie die DNA. Bevor die mRNA aus dem Kern tranportiert und in ein Protein übersetzt werden kann, müssen diese Abschnitte aus dem pre-mRNAStrang herausgeschnitten werden. Dieses sogenannte Spleißen findet im Zellkern statt und wird von supramolekularen Komplexen, den Spleißosomen, katalysiert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.3: Die normale, unreife mRNA enthält neben drei codierenden Abschnitten, den sogenannten Exons, zusätzliche nicht-codierende Sequenzen, die Introns [Albe97].

Ein Spleißosom besteht aus mehr als 70 Proteinen und besitzt ein Molekulargewicht von ca. 4 , 8 M Da. Der Aufbau eines Spleißosoms entsteht durch die sequentielle Bindung unterschiedli- cher ”smallnuclearribonucleoprotein“-Partikel(snRNPs),dienurimZellkernvorkommen,an die pre-mRNA. Das zuerst bindende snRNP ist das hier untersuchte U[1]-snRNP. Danach folgen die anderen snRNPs U[2], U[4], U[5] und U[6] [Star01]. Dieser fundamentale zellbiologische Prozeß ist in Abbildung 1.5 schematisch dargestellt. Die snRNAs der unterschiedlichen U-snRNPs wer- den im Kern synthetisiert und anschließend ins Cytoplas- ma transportiert. Hier binden sieben, für alle U-snRNPs identische, Sm-Proteine an die snRNA und formen einen ribonukleo-Protein Komplex. Zusätzlich binden einige für jede U-snRNA spezifische Proteine an diesen Sm-Kern. Die reifen snRNP-Partikel werden mittels Importrezeptoren in den Zellkern reimportiert. Abbildung 1.4 zeigt die Struktur eines U1-snRNPs nach neuesten elektronenmikroskopischen Untersuchungen [Star01]. Der auffälligste Teil ist die vom Sm-Kern gebildete ringförmige Struktur mit einem Außendurchmesser von ca. 8 nm. Die zwei großen spezifischen Proteine (70 K und U1-A), die an den Ring gebunden sind, haben je einen Durchmesser von ca. 5 nm. Die charakteristische Ver- snRNP-Partikels [Star01]. Beispiel für die hohe räumliche und zeitliche Organisation des

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.4: Struktur eines U1 teilung der U1-snRNP-Partikel im Zellkern ist ein bekanntes

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.5: (A) Schematische Darstellung des Spleißprozesses. U1 und U2 binden zuerst an die Spleißstellen und bilden u.a. mit U4, U5 und U6 das Spleißosom. Dieses schneidet die Intronsequenz in Form einer Schlinge aus der unreifen mRNA heraus und verbindet die Exons miteinander zur reifen mRNA [Albe97]. (B) Die Verteilung von Spleißfaktoren im Zellkern bildet ein charakteristisches Muster. Neben einer im Kern homogen verteilten Fraktion, sind die meisten Spleißfaktoren in den sogenannten Speckles akkumuliert (Balken 5 μ m) [Mist98].

Zellkerninneren [Slee99][Mist00][Lewi00]. Immunofluoreszenzfärbungen mit Antikörpern gegen Spleißfaktoren und die direkte Abbildung fluoreszenzmarkierter U1-snRNPs zeigen, daß die U1Partikel in räumlich begrenzten Regionen im Kern akkumulieren (vgl. Abb. 1.5 (B) und 4.12). Die hellen Spots, ”Speckles“genannt,setzensichindenBilderndeutlichvoneinemdunkleren, homogenen Hintergrund ab. Die genaue Entstehung und Funktion dieser subnukleären Kompartimente ist allerdings noch immer ungeklärt.

1.3.4 Zum Kern-Zytoplasma-Transport

Zur Messung der Dynamik einzelner fluoreszenzmarkierter Proteine im Zellkern, müssen die Probenmoleküle zunächst in geeigneter Weise in den Kern eingebracht werden. Prinzipiell eignet sich hierfür die direkte Mikroinjektion der Moleküle. Durch den mechanischen Einfluß des Injektionsvorgangs wird die Kernarchitektur allerdings empfindlich gestört. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher das Transportsystem nach [Adam90] verwendet. Die Zellen transportieren die Probenmoleküle dabei aktiv, d.h. unter Energieverbrauch, in den Zellkern, dessen innere Struktur dadurch intakt bleibt.

Der gesamte Austausch von Molekülen zwischen Zytoplasma und Zellkern erfolgt über die Kernporenkomplexe ( ”nuclearporecomplex“,NPC).DiesesupramolekularenStruktureninder Kernmembran bestehend aus [50]-[100] Proteinen mit einer Gesamtmasse von [120] M Da. Kleine Moleküle (20-40 kDa) können passiv durch die NPCs diffundieren. Für große Moleküle gibt es hingegen eine Reihe von signalund temperaturabhängigen Importund Exportmechanismen. Hauptsächlich werden nukleäre Proteine, ribosomale Proteine und reife snRNPs in den Kern importiert und mRNAs, tRNAs, snRNAs und pre-Ribosomen aus dem Kern in das Zytoplasma exportiert.

Der Import wird maßgeblich durch eine Anzahl von Importfaktoren, den Karyopherinen, gesteuert. Diese zytoplasmatischen Transportrezeptoren, z.B. das Importin −α, erkennen Kernlokalisationssequenzen (NLS) und binden an die Proteine, die in den Kern transportiert werden sollen. Anschließend bindet Importin- β an das Importin- α. Dieser gesamte Komplex kann dann durch die NPCs in den Kern translokiert werden. Im Kern dissoziiert der Komplex unter Energieverbrauch und die Importfaktoren werden in das Zytoplasma exportiert, um weitere Importprozesse zu ermöglichen.

2 Theoretischer Teil

Im Rahmen dieser Arbeit wurden theoretische und fluoreszenzmikroskopische Methoden entwickelt, die eine direkte Visualisierung einzelner Moleküle in biologischen Systemen erlauben und die Analyse ihrer Trajektorien ermöglichen. Das Zustandekommen und die Eigenschaften der detektierten Bilder ist ein komplexer Vorgang, der von vielen einzelnen Faktoren abhängt. Die Abbildungscharakteristik des Mikrokops, die Fluoreszenzeigenschaften der Moleküle und die Art der Detektion der Signale wirken sich grundlegend auf die resultierenden Bilder aus. Da man sich mit einem bestimmten experimentellen Aufbau längerfristig auf diese grundlegenden Komponenten (z.B. Mikroskopstativ, Objektiv, Laser und CCD-Kamera) festlegt, ist es angebracht, die Eigenschaften der Signale möglichst vor dem Aufbau abzuschätzen.

Neben den Bauteilen des Mikroskops sind die Eigenschaften der untersuchten Probe von entscheidender Bedeutung. Die räumliche Ausdehnung der Probe, störende Hintergrundsignale und die Geschwindigkeit, mit der sich die Probenmoleküle bewegen, entscheiden häufig darüber, ob die Moleküle überhaupt detektiert werden können. Die Bewegung der Moleküle erfolgt in der Regel in drei Dimensionen. Die Abbildung der Trajektorien mit einem Flächendetektor ist daher eine zweidimensionale Projektion. Es stellt sich somit nicht nur die Frage, wie sich diese Projektion direkt auf die Bilder auswirkt, sondern auch, welche Informationen sich aus den zweidimensionalen Daten gewinnen lassen und wie diese zu analysieren und zu interpretieren sind.

Der folgende theoretischen Teil soll daher zunächst die prinzipiellen Zusammenhänge des komplexen Abbildungsprozesses mobiler submikroskopischer Objekte in einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop erläutern.

2.1 Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie

Damit bestimmte Strukturen in einer mikroskopischen Probe visualisiert werden können, müssen sich diese im resultierenden Bild vom Rest der Probe unterscheiden, d.h. man benötigt einen geeigneten Kontrast. Für das menschliche Auge und elektronische Lichtdetektoren sind prinzipiell Hell-Dunkel-Kontraste aufgrund unterschiedlicher Lichtintensitäten und spektrale Kontraste aufgrund unterschiedlicher Wellenlängen geeignet. Der Kontrast eines mikroskopischen Bildes ist allerdings keine inhärente Eigenschaft der Probe. Kontrast ist vielmehr ein Resultat der Wechselwirkung des beleuchtenden Lichts mit der Struktur der Probe und der Art und Weise, wie das Mikroskop das von der Probe ausgehende Licht weiterverarbeitet.

In dieser Arbeit werden ausschließlich Fluoreszenzfarbstoffe zur Erzeugung eines Kontrasts verwendet. Fluoreszenzfarbstoffe haben die Eigenschaft, Licht einer bestimmten Wellenlänge λ exc zu absorbieren und nach kurzer Zeit als Fluoreszenzlicht größerer Wellenlänge λ fl zu emittieren. Durch zahlreiche biochemische Techniken ermöglicht die Fluoreszenzmarkierung eine gezielte Manipulation der Probe dahingehend, daß genau die Strukturen markiert und sichtbar werden, die zur Analyse notwendig sind. Die hohe Spezifität und Sensitivität hat diese Methode gerade in der zellbiologischen Forschung mittlerweile zu einem unverzichtbaren Werkzeug gemacht.

2.1.1 Prinzipieller Aufbau und Bildentstehung

Die Abbildung einzelner fluoreszenzmarkierter Proteinmoleküle in biologischen Proben wurde in einem Weitfeld-Mikroskop mit einem Unendlichstrahlengang realisiert. Die Objektebene fällt hier mit der Fokusebene des Objektivs zusammen, so daß die eigentliche Abbildung nicht vom Objektiv allein, sondern nur in Kombination mit den Tubuslinsen erfolgt. In den parallelen Strahlenverlauf zwischen Tubuslinsen und Objektiv können auf diese Weise einfacher zusätzliche optische Komponenten, z.B. Fluoreszenzfilter, angebracht werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.1: Prinzipieller Aufbau und Strahlen gang eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops.

Im Gegensatz zum konfokalen Rastermi- kroskop oder zu einem optischen RasterNahfeldmikroskop ist das prinzipielle Funktionsprinzip und damit der Aufbau dieses Mikroskops relativ einfach (s. Abb. 2.1). Ein Laserstrahl beleuchtet eine Leuchtfeldblende. Diese wird von der Tubuslinse und dem Objektiv in die Probe abgebildet. Dort werden die Fluoreszenzmoleküle angeregt. Das Objektiv sammelt einen Teil des emittierten Lichts, das von einem passenden Fluoreszenzfiltersatz vom Laserlicht getrennt wird und bildet mit der Tubuslinse die Probe auf denDetektor ab, z.B. auf die hier verwendete hochsensitive CCD-Kamera. Dies ermöglicht durch die anschließende digitale Bildverarbeitung eine gezielte Auswertung der Bildinformationen. Im realisierten Aufbau kann dabei das Bild auch mit den Augen durch die Okulare des Mikroskopstativs beobachetet werden. Der Strahlengang verdeutlicht, daß im Weitfeld-Mikroskop weder der Anregungsnoch der Detektionsstrahlengang in axialer Richtung eingeschränkt sind. Dadurch werden auch Bereiche außerhalb der Objektebene beleuchtet und zur Fluoreszenz angeregt. Der Verzicht auf die punktweise Beleuchtung der Probe verhindert zwar den Einsatz einer konfokalen Lochblende im Detektionsstrahlengang und damit die Unterdrückung der Hintergrundfluoreszenz aus nicht-fokalen Ebenen. Der entscheidende Vorteil ist allerdings der enorme Gewinn bei der Zeitauflösung, da an Stelle der sequentiellen Bildaufnahme bei der punktförmigen Abrasterung die simultane Detektion des gesamten Bildes mit einem Flächendetektor tritt. Typische Aufnahmezeiten mit einem konfokalen Rastermikroskop liegen im Bereich von 1 sec. Im Weitfeld-Mikroskop ist diese Zeit nur von der Integrationszeit abhängig und kann schon bei mittleren Fluoreszenzintensitäten bis auf 1 ms reduziert werden. Ein weiterer Vorteil ist die deutlich höhere Detektionseffizienz eines WeitfeldMikroskops, weil die konfokale Blende, je nach eingesteller Größe, einen erheblichen Teil des Lichts vor dem Detektor ausblendet.

2.1.2 Punktübertragungsfunktion eines Weitfeld-Mikroskops

Gegeben sei ein inkohärent leuchtendes, punktförmiges Objekt, z.B ein Fluoreszenzmolekül, in der Fokusebene Σ F des Objektivs L O (s. Abb. 3.1). Wie sieht die Intensitätsverteilung in der Bildebene Σ B des Mikroskops aus? Die Objektivlinse L O kann aufgrund seiner endlichen Apertur das Licht lediglich aus einem Bruchteil des gesamten Raumwinkels erfassen. Der maximale Winkel, aus dem das Licht noch gesammelt wird, ist 2 α, wobei α der halbe Öffnungswinkel des Objektivs ist. An dieser strahlbegrenzenden Objektiva- pertur tritt Fraunhofer-Beugung auf. Für die Abbildung bedeutet das: Anstelle eines idealen Bildpunkts entsteht eine sogenannte Airy-Verteilung mit endlicher Ausdehnung in der Bildebene Σ B. Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit ist die Abbildung punktförmiger Objekte, die sich in einer dreidimensionalen Probe frei bewegen können, also auch entlang der optischen Achse des abbildenden Systems. Das bedeutet, daß sich die Objekte nicht zwangsweise in der Fokusebene Σ F des Objektivs befinden müssen. Ein genaues Verständnis der Bildstruktur erfordert daher die Betrachtung der Intensitätsverteilung in Σ B auch dann, wenn sich das punktförmige Objekt nicht exakt in der Fokusebene befindet. Diese dreidimensionale Intensitätsverteilung, auch Punktübertragungsfunktion (PSF) genannt, wird im folgenden in paraxialer Näherung genauer betrachtet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.2: Zur Bildentstehung im WeitfeldMikroskop. Ein Teil des Lichts eines punktförmigen Strahlers in der Fokusebene Σ F wird vom Objektiv L O gesammelt und von der Tubuslinse L T in die erste Zwischenbildebene abgebildet. Hier befindet sich der Detektor. Der Abbildungsvorgang wird dabei entscheidend vom Öffnungswinkel α des Objektivs beeinflußt. Je größer der Winkel ist, desto mehr Licht wird gesammelt und desto höher ist die Auflösung des Objektivs.

Die Intensitätsverteilung in Σ B für das skizzierte Abbildungssystem ergibt sich zu [Born99]:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

J 0 ist die Bessel-Funktion nullter Ordnung. Die dimensionslosen optischen Koordinaten in lateraler (v) und axialer Richtung (u) sind definiert als

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei ist NA = n sin (α) die numerische Apertur des Objektivs. Die axiale Koordinate u wird hier in einer leicht abgewandelten Form für hochaperturige Objektive definiert [Wils84].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3: Die berechnete PSF des Weitfeldmikroskops in paraxialer Näherung für NA=1,4 und λ =520 nm. Die beiden oberen Bilder zeigen die laterale Intensitätsverteilung bei z =0, die unteren die Verteilung in der x - z -Ebene. Die PSF ist symmetrisch zur optischen Achse und zur geometrischen Fokusebene. Nach einer Skalierung der relativen Intensitätswerte erkennt man lateral den Verlauf der Airy-Funktion mit den typischen Beugungsringen. Das erste Minimum der Funktion gibt den Radius des Beugungsscheibchens an. In axialer Richtung ist das Beugungsmuster deutlich ausgedehnter und komplexer. Lateral und axial nimmt die Intensität der Nebenmaxima mit zunehmendem Abstand vom Zentrum ab. Das erste Nebenmaximum der Airy-Verteilung hat lediglich eine Intensität von 1,75% des Hauptmaximums. Das erste axiale Nebenmaximum für x =0 entsprechend 4,7%.

Betrachtet man den Realund Imaginärteil des Integrals aus Gleichung 2.1 getrennt, so ergibt sich

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Berechung dieser Integrale kann mittels sogenannter Lommel-Funktionen erfolgen. Zur einfacheren numerischen Berechnung der Intensitätsverteilung wurden diese Integrale jedoch jeweils durch eine Summe mit hinreichend kleinem Summationsintervall d ρ = ϵ /N ersetzt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.3 zeigt die berechnete PSF in lateraler und axialer Richtung für eine numerische Apertur von 1,4 und einer Wellenlänge von 520 nm. Das zentrale Maximum in der Bildebene enthält etwa 84% des gesamten Lichts des Beugungsbildes und stellt im wesentlichen das Bild des Objektpunkts dar. Die Abbildung eines komplexeren, inkohärent leuchtenden Gegenstandes kann als Überlagerung vieler einzelner, unabhängiger Airy-Muster aufgefaßt werden. Diese beugungsbedingte Ausdehnung der Bildpunkte setzt der Unterscheidbarkeit von Objektstrukturen eine prinzipielle Grenze. Eine genauere Betrachtung des Auflösungsvermögens erfolgt im nächsten Abschnitt.

2.1.3 Auflösung eines Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops

Zur Definition der Auflösung werden die Intensitätverteilungen in der Bildebene Σ B und entlang der optischen Achse betrachtet. Aus Gleichung 2.1 erhält man mit u = 0 [Born99]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

Abbildung 2.4: Zur Definition der Auflösung eines Mikroskops. Die Profile entlang der optischen Achse und in der Bildebene ergeben sich aus der berechneten PSF (s. Glg. 2.3) für x = y =0 bzw. z =0. In der Praxis ist eine Messung der FWHM einfacher als die Bestimmung des ersten Minimums für das RayleighKriterium. Die laterale Auflösung ist nach Gleichung 2.13 FWHM xy ≈ 193 nm. Axial ergibt sich entsprechend FWHM z ≈ 492 nm.

Abbildung 2.4 verdeutlicht die endliche Ausdehnung des zentralen Maximums der PSF sowohl in lateraler als auch in axialer Richtung. Besitzen zwei Objektpunkte in der Fokusebene einen geringeren Abstand als der Durchmesser d des Beugungsscheibchens, überlagern sich diese. Da die zunehmende Überlagerung zweier Beugungsverteilungen fließend mit abnehmendem Abstand der Objektpunkte erfolgt und damit vom Kontrast der resultierenden Verteilung abhängt [Stel98], verwendet man im allgemeinen zur Bestimmung der Auflösung die Definition anhand des Rayleigh-Kriteriums. Demnach werden zwei Objektpunkte von einem optischen System gerade noch aufgelöst, wenn das Maximum des einen Beugungsscheibchens in das erste Minimum der anderen Beugungsverteilung fällt. Dies entspricht lateral genau dem Abstand bis zum 1. Minimum J 1=0. Dieses Minimum liegt bei r =3,83 optischen Einheiten. Mit Gleichung 2.2 folgt daraus für die laterale Auflösung, r xy

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Analoges gilt in axialer Richtung. Das erste Minimum liegt hier bei ±π, so daß für die axiale Auflösung gilt

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zur praktischen Messung der Auflösung ist diese Definition allerdings wenig geeignet, da zur Bestimmung des Minimums eine Abbildung des 1. Nebenmaximums erforderlich wäre. Dies ist experimentell jedoch aufgrund der schwachen Signale nur selten möglich. Die Bestimmung der vollen Halbwertsbreite ( ”Full-Width-at-Half-Maximum“,FWHM)deszentralenMaximumsist hingegen relativ einfach und wird daher dem Kriterium nach Rayleigh als Definition für die Auflösung vorgezogen. Der Zusammenhang ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Berechnung der Auflösung in der hier verwendeten paraxialen Näherung berücksichtigt keinerlei optische Effekte, die durch Unterschiede der Brechungsindizes zwischen Probenmedium und Objektivlinse oder dem vektoriellen Charakter des Lichts entstehen können und gilt lediglich für Objektive geringer numerischer Apertur. Eine exakte Auswertung der Beugungsintegrale für hochaperturige Objektive zeigt zwar eineÄnderung der Symmetrie der PSF, bezogen auf die berechnete Auflösung sind die Unterschiede jedoch zu vernachlässigen [Verb97].

2.1.4 Näherung der PSF durch eine Gauß-Funktion

Das komplexe Beugungsmuster der PSF eines Weitfeld-Mikroskops erschwert die analytische Beschreibung der Abbildungsvorgänge und die Auswertung der Bilddaten. Die für die Datenanalyse interessanten Parameter der PSF Position, Amplitude und Breitewerden überwiegend durch das zentrale Hauptmaximum festgelegt. Zudem werden die Nebenmaxima der Beugungsverteilung in der Regel nicht detektiert, da die Signale eine zu geringe Intensität besitzen. Die PSF läßt sich daher gut durch eine relativ einfache dreidimensionale Gauß-Funktion beschreiben [Kues97][Kubi99]. Da im Rahmen dieser Arbeit lediglich die zweidimensionale Projektion der PSF detektiert wird, erfolgt die Analyse der lateralen Intensitätsverteilung mit einer zweidimensionalen Gauß-Funktion der Form

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

wobei I s die Signalamplitude an der Position (x, y) über dem Hintergrundsignal I b ist. Die Breite der Verteilung ist durch σ xy definiert. Die Umrechnung in die Halbwertsbreite erfolgt durch die einfache Relation

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.5: Das Hauptmaximum der lateralen PSF läßt sich durch eine relativ einfache GaußFunktion beschreiben. Die Nebenmaxima, die bei den experimentell zu erwartenden schwachen Signalen in der Regel nicht detektiert werden, bleiben dabei unberücksichtigt. Die Abbildung verdeutlicht die gute Übereinstimmung der beiden Funktionen. Zur Auswertung der experimentellen Bilddaten wird daher ausschließlich die Gauß-Funktion verwendet.

2.1.5 Laterale Intensitätsverteilung bei einer Defokussierung

Die vorangegangenen Abschnitte zur Charakterisierung der PSF setzten voraus, daß sich das fluoreszierende punktförmige Objekt in der Fokusebene des Objektivs befindet. Bei der Abbildung mobiler Moleküle befinden sich die Objekte jedoch nur selten exakt in der fokalen Ebene. Freie Diffusion in axialer Richtung führt beispielsweise zu einer rein zufälligen Bewegung in die fokale Ebene hinein oder aus ihr heraus. Dadurch wird das entsprechende Molekül ”unscharf“ abgebildet und die Intensitätsverteilung verändert sich. Das Verhalten der lateralen FWHM bei einer Defokussierung ist vor allem zur Bestimmung des axialen Sichtbarkeitsintervalls interessant (s. Abschnitt [2].[6].[4].[1]). Darüberhinaus läßt sich überprüfen, ob die im vorherigen Abschnitt gezeigte Näherung der PSF durch eine Gauß-Funktion bei der Defokussierung noch gerechtfertigt ist.

Die Höhenprofile in Abbildung [2].[6] zeigen die berechneten lateralen Intensitätsverteilungen mit zunehmendem Abstand zur Fokusebene (z =0). Die deutlichste Veränderung ist die Abnahme der Intensität des Hauptmaximums mit steigendem Abstand. Der funktionelle Zusammenhang zwischen der Amplitude und dem Abstand z folgt aus dem Profil der PSF entlang der optischen Achse (s. Abb. 2.4 und Glg. 2.10). Somit erscheinen im Zentrum der Verteilung abwechselnd Maxima und Minima. Aufgrund der Energieerhaltung bleibt die integrale Zahl der Photonen in der Bildebene konstant und verteilt sich mehr und mehr auf die Nebenmaxima der Beugungsverteilung. In Abbildung 2.6 erkennt man deutlich den Anstieg der Intensität und die Verbreiterung des ersten und zweiten Nebenmaximums sowie das Verschwinden des ersten Minimums. Sobald die Intensität des Hauptmaximums die des ersten Nebenmaximums unterschreitet ist eine

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.6: Die in paraxialer Näherung berechnete laterale Intensitätsverteilung in Abhängigkeit vom axialen Abstand zur Fokusebene. Bis zu einem Abstand von [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 0 , 3 μ m ändert sich im wesentlichen die Intensität des zentralen Beugungsscheibchens, die bei [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 400 nm nur noch 10% beträgt. Die detektierten Photonen verteilen sich mehr und mehr auf die Nebenmaxima, bis das Signal im homogenen Untergrund verschwindet.

Näherung durch einen Gauß-Fit nicht mehr möglich. Dies tritt bei der hier berechneten PSF in einem Abstand zur Fokusebene von [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 430 nm ein. Zudem beträgt dann die maximale Intensität nur noch 10% des fokussierten Signals, so daß bei relativ schwacher Fluoreszenz die Abbildung eines Moleküls bei zu großem Abstand zur Fokusebene lediglich zu einem homogenen Untergrundsignal führt. Der Anstieg der Nebenmaxima führt zu einer Verbreiterung des Hauptmaximums der lateralen PSF. Abbildung 2.7 zeigt die aus den berechneten Verteilungen bestimmten FWHMs in Abhängigkeit vom Abstand zur fokalen Ebene. Die Breite wurde einmal direkt durch Berechnung der FWHM bestimmt und zusätzlich mit einem Gauß-Fit nach Gleichung 2.15, aus dem dann die FWHM berechnet wurde. Ab einem Abstand von [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 300 nm steigt die FWHM sprunghaft an, da sich die Intensität des Hauptmaximums dem ersten Nebenmaximum nähert. Was folgt aus den vorangegangenen Betrachtungen für die Abbildung einzelner mobiler Moleküle in einer dreidimensionalen Probe?

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.7: Abhängigkeit der Breite der lateralen Intensitätsverteilung vom Abstand zur Fokusebene. Die Kurven wurden aus der berechneten PSF aus Abbildung 2.3 bestimmt. Die rote Kurve zeigt die Breite eines Gauß-Fits an die Profile und die schwarze Kurve die direkt berechnete FWHM. Bis ca. 300 nm ist die Verbreiterung zu vernachlässigen. Sobald sich jedoch die Intensität des Hauptmaximums dem Nebenmaximum annähert, steigt die Breite sprunghaft an.

Die Abnahme der Intensität des Beugungsscheibchens beschränkt die Sichtbarkeit auf ein Intervall Δ z um die Fokusebene. Moleküle außerhalb dieses Intervalls erzeugen lediglich ein Untergrundsignal. Bei geringer Teilchenkonzentration ist dieses Signal sehr schwach und die Moleküle innerhalb von Δ z bleiben über dem Untergrund sichtbar. Eine genauere Charakterisierung des Sichtbarkeitsintervalls erfolgt in Abschnitt 2.6.4.1.

2.2 Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle

Fluoreszenz ist die häufigste Art der Kontrasterzeugung bei der Untersuchung biologischer Systeme, weil Fluoreszenz weitaus sensitiver und spezifischer ist als z.B. Absorption oder Reflexion. Die folgenden Abschnitte beschäftigen sich daher mit den grundlegenden Eigenschaften der Fluoreszenzmoleküle, vor allem im Hinblick auf die Optimierung der Bildaufnahmeparameter. Fluoreszenzmikroskopie basiert auf der Eigen- schaft der Fluoreszenzfarbstoffe, Licht einer bestimmten Wellenlänge λ exc zu absorbieren und nach kurzer Zeit ( [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 10 − [9] s) als Fluoreszenzlicht größerer Wellenlänge λ fl zu emittieren. Eine grundlegende quantitative Beschreibung der Fluoreszenz läßt sich aus einem einfachen Energie-Term-Schema eines Farbstoffmoleküls ableiten, wie es in Abbildung 2.8 gezeigt ist. Im elektronischen Grundzustand S 0 absorbiert das Molekül mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit, die von der Anregungsintensität und der Wellenlänge abhängt, ein Photon und geht in höhere Schwingungszustände des ersten angeregten elektronischen Singulett-Zustands S 1 über. Von dort relaAbbildung 2.8: Vereinfachtes Energie-Termxiert es schnell (τ [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] 10 − [12] s) und strahlungslos Schema eines Fluoreszenzmoleküls im Vier-Niveauin den niedrigsten Schwingungszustand von Modell mit den entsprechenden Übergangsraten. S 1. Die Fluoreszenzemission erfolgt in einen der Schwingungszustände des elektronischen Grundzustands S 0. Durch dieÜbergänge in die höheren Schwingungszustände der elektronischen Niveaus und die damit verbundenen strahlungslosen Relaxationen ist das Fluoreszenzlicht gegenüber dem Anregungslicht energieärmer und zu roten Wellenlängen verschoben. Dieser Energieverlust führt zum bekannten StokesShift der Fluoreszenz.

Neben dem Übergang S 1 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] S 0 kann das Molekül in den Triplettzustand T 1 übergehen (”Intersystem-Crossing“).DieWahrscheinlichkeitistzwarumeinigeGrößenordnungenkleiner, aber die relativ lange Lebensdauer dieses Zustands führt zu Sättigungseffekten der Fluoreszenz, da das Molekül, solange es in T 1 verweilt, kein Photon absorbieren und demnach kein Fluoreszenzphoton abgegeben kann.

Ein Molekül kann aus angeregten Zuständen (S 1 oder T 1) durch photochemische Prozesse zerstört werden (Zustand B) und liefert damit kein Fluoreszenzsignal mehr. Dieser Photolyseprozeß limitiert prinzipiell die Informationsmenge, die sich von einer markierten Probe gewinnen läßt. Im gezeigten Modell erfolgt derÜbergang nach B zur Vereinfachung lediglich aus dem Zustand T 1. Die Zusammenhänge zwischen Anregungsintensität, Sättigungsverhalten, Fluoreszenzund Übergangsraten lassen sich aus den zeitabhängigen Bilanzgleichungen des skizzierten Modells ableiten.

2.2.1 Singulettsättigung

Zunächst werden der Triplettund der gebleichte Zustand B vernachlässigt, d.h. k isc =0 und k bl =0. Die Fluoreszenzrate R fl in diesem einfachen Zwei-Niveau-Modell ist direkt proportional zur Besetzungswahrscheinlichkeit W S 1 des Zustands S 1

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

mit der Übergangsrate k fl von S 1 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] S 0 und der Fluoreszenzquantenausbeute φ fl (φ fl < 1). Letztere ist der Anteil der fluoreszierenden Übergänge an allen möglichenÜbergängen S 1 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] S 0. Die Besetzungswahrscheinlichkeit W S 1 ist gegeben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Rate k a, mit der der optische Übergang S 0 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] S 1 gepumpt wird, ist gegeben durch mit dem Photonenflux I ill

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

schnitt σ a cm [2]] des Moleküls bei der entsprechenden Anregungswellenlänge. Somit ergibt sich für die Fluoreszenzrate

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Demnach steigt im angenommenen Fall die Fluoreszenzrate mit steigender Beleuchtungsintensität zunächst linear an und geht dann in eine Sättigung über. Die maximale Emissionsrate erhält man für den Grenzfall I ill [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] ∞

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Wir definieren die Sättigungsintensität I sat als die Anregungsintensität, bei der die Fluoreszenzrate die Hälfte der Maximalrate R max erreicht. Für die Sättigungsintensität des Singulettzustands ergibt sich

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1-20 kW/cm [2]. Der nächste Abschnitt verdeutlicht, daß eine höhere Anregungsintensität aufgrund der viel eher einsetzenden Triplettsättigung keine Steigerung der Fluoreszenzrate bewirkt.

2.2.2 Triplettsättigung

Die Übergangsrate k isc von S 0 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] T 1 ist in der Praxis nicht zu vernachlässigen, da der relativ langlebige Triplettzustand die Fluoreszenzrate beschränkt. Der Effekt der Triplettsättigung setzt bei wesentlich geringeren Anregungsintensitäten als die Singulettsättigung ein und wirkt somit als ”Flaschenhals“ fürdie Helligkeiteinzelner Fluoreszenzmoleküle. DieRate,mitderdieBe- setzung des Triplettniveaus T 1 erfolgt, ist proportional zur Besetzung von S 1 und nimmt daher mit steigender Anregungsintensität zu

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Lösung der Ratengleichungen für das entsprechende Drei-Niveau-System ergibt für die Besetzungswahrscheinlichkeit und die Emissionsrate [Oste98]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2.9: Zum Sättigungsverhalten der Fluoreszenzrate R fl bei steigender Anregungsintensität I ill. Die linke Grafik zeigt die absolute Emissionsrate in Abhängigkeit von der Anregungsintensität. Die rechte Kurve zeigt den Verlauf normiert auf die maximale Emissionsrate und die Sättigungsintensität.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Zahl der emittierten Fluoreszenzphotonen N fl ergibt sich aus dem Produkt der Emissionsrate und der Belichtungszeit t ill zu

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In Abbildung 2.2.2 ist der Verlauf der Funktion 2.27 gezeigt. Zusätzlich ist die Emissionsrate ohne Triplettsättigung nach Gleichung 2.20 angegeben.

2.2.3 Lichtinduziertes Bleichen

Im vorhergehenden Abschnitt wurde das Bleichen der Farbstoffmoleküle (Zustand B) nicht berücksichtigt. Nach Gleichung 2.28 steigt die Anzahl der emittierten Photonen linear mit der Belichtungszeit an. Demnach wäre es möglich, durch eine entsprechend lange Belichtungszeit, eine unbegrenzte Zahl an Fluoreszenzphotonen zu detektieren. Prinzipiell ist dies allerdings aufgrund der einsetzenden Photolyse nicht realisierbar. Im Mittel werden die Farbstoffmoleküle nach einer charakteristischen Photobleichzeit τ bl zerstört, wobei das Molekül mit der Bleichrate k b in den Zustand B übergeht. In diesem Zustand kann das Molekül nicht mehr absorbieren und emittiert daher keine Photonen mehr. Dieser Prozeß begrenzt daher prinzipiell die Beobachtungsdauer einzelner Moleküle mit einem Fluoreszenzmikroskop.

Die Photobleichung erfolgt aus angeregten Zuständen (z.B. S 1 , T 1) und weist daher eine ähnliche Abhängigkeit von der Anregungsleistung I ill auf wie die Fluoreszenzintensität. Die an der Bleichung beteiligten photochemischen Prozesse sind allerdings im Detail noch immer nicht verstanden und Gegenstand aktueller Forschung [Harm01][Göhd00][Oste98]. Der quantitative Verlauf der Bleichkinetik wird daher im Rahmen dieser Arbeit nur empirisch bestimmt.

Der prinzipielle zeitliche Verlauf der Bleichung läßt sich anhand einer Ensemblemessung erläutern. Hierbei wird eine exponentielle Abnahme der Fluoreszenzintensität bei konstanter Bestrahlungsstärke gemessen. Je höher die Bestrahlungsstärke ist, desto schneller bleichen die Moleküle. Die Bleichrate R bl muß somit von der Intensität abhängen. Zudem besitzen Farbstoffmoleküle eine charakteristische Bleicheffizienz φ bl, analog der Fluoreszenzquantenausbeute φ fl. Diese ist unabhängig von der Anregungsintensität und gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der ein Molekül nach der Absorption eines Photons bleicht und ist demnach definiert als [Harm01][Pawl95]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Rate der Photobleichung ergibt sich also aus dem Produkt der Rate für die Anregung und der Bleicheffizienz zu

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Anregungsrate ist zwar einfachen Fluoreszenzmessungen nicht direkt zugänglich, kann aber durch Messung der Fluoreszenzrate unter der Berücksichtigung der Quantenausbeute φ fl ermittelt werden. Unter der Voraussetzung, daß R bl für alle Farbstoffmoleküle gleich ist, wird die Zahl der Moleküle, die pro Zeiteinheit bleichen, beschrieben durch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Einfache Integration dieser Gleichung liefert den Verlauf der Bleichkinetik für eine Ensemble- messung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

N 0 ist die Anzahl der fluoreszierenden Moleküle zum Zeitpunkt t =0. Die Anzahl der noch fluoreszierenden Moleküle nimmt demnach exponentiell mit der Dauer der Beleuchtung und damit mit der Beobachtungszeit ab. Die mittlere Bleichzeit ist

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Daraus ergibt sich die mittlere Zahl der maximal emittierten Photonen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Wie tritt der Bleichprozeß auf molekularer Ebene in Erscheinung? Die Beobachtung einzelner Farbstoffmoleküle zeigt, daß der Bleichvorgang bei konstanter Beleuchtung nicht exponentiell, sondern in einem Schritt erfolgt. Man nennt diesen Vorgang auch Molekül nur in den Zuständen fluoreszierend ( ”digitalesBleichen“,weildas ”an“)odergebleicht(”aus“)vorkommt.Dasex- ponentielle Abklingen der Fluoreszenz einer Ensemblemessung ist bei der Beobachtung einzelner Moleküle als die Wahrscheinlichkeit p zu interpretieren, mit der das Molekül nach der Zeit t ill noch fluoresziert

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für die Bleicheffizienz φ bl folgt mit Gleichung 2.33

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Durch eine Messung der Bleichzeit in Abhängigkeit der Anregungsintensität kann somit die Bleicheffizienz quantitativ bestimmt werden.

2.2.4 Anzahl der emittierten Photonen

Die Anzahl der im Mittel emittierten Photonen wird bei Berücksichtungung der Photolyse nicht mehr durch Gleichung 2.28 beschrieben. Die endliche Lebensdauer der Farbstoffmoleküle läßt sich mit Gleichung 2.35 durch eine mit der Zeit abnehmende Photonenemissionsrate ausdrücken

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Somit ergibt sich die mittlere Zahl der Fluoreszenzphotonen zu ∫ [ ][ ]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3 Fluoreszenz mehrfach-markierter Proteinmoleküle

Im vorangegangenen Abschnitt wurde die Fluoreszenzund Bleichcharakteristik einzelner Farbstoffmoleküle analysiert. Die Detektion einzelner Proteine im Innern eines Zellkerns erfordert aufgrund der schwachen Fluoreszenzsignale einzelner Farbstoffmoleküle und der starken Lichtstreuung in der Regel eine Markierung mit mehreren Farbstoffmolekülen pro Proteinmolekül.

Die mehrfach markierten Proteinmoleküle sind dann bei gleicher Anregungsintensität ”heller“ und können dann trotz Lichtstreuung und eventuell vorhandenem Untergrundsignal detektiert werden. Dazu ist in der Regel ein Minimalmarkierungsgrad m min notwendig.

Darüber hinaus erlauben hohe Markierungen über m min hinaus eine Reduktion der Anregungsintensität und verlängern somit die Bleichzeit und die Sichtbarkeit eines Proteinmoleküls. Daher wird hier ein vereinfachtes Modell für die Signale und das Bleichen von im Mittel m -fach markierten Proteinen eingeführt. Dieses Modell berücksichtigt keine eventuellen Veränderungen im Absorptionsoder Emissionsspektrum der einzelnen Farbstoffmoleküle, wie sie durch die chemische Bindung an das Proteinmolekül entstehen können.

2.3.1 Sättigungsintensität und maximale Fluoreszenzrate

Der Sättigungseffekt bei steigender Anregungsintensität tritt für jedes einzelne Farbstoffmolekül auf. Die Sättigungsintensität bleibt daher unverändert und ist durch Gleichung 2.26 gegeben. Die absolute maximale Fluoreszenzintensität R max ist ein m -faches der Intensität eines einzelnen Moleküls (s. Glg. 2.25)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.3.2 Lichtinduziertes Bleichen

Die Wahrscheinlichkeit, daß ein einzelnes Farbstoffmolekül nach der Zeit t ill noch fluoresziert, wird durch Gleichung 2.35 beschrieben. Der Mittelwert ist τ bl und identisch mit der mittleren Sichtbarkeitsdauer τ vis dieses Farbstoffmoleküls. Zu diesem Zeitpunkt ist die Wahrscheinlichkeit, daß das Molekül noch fluoresziert und sichtbar ist, auf 1 / e gefallen. Wie lang ist die Sichtbarkeitsdauer τ vis eines m -fach markierten Proteins? Die Photonenemissionsrate ergibt sich mit den Gleichungen 2.37 und 2.39 zu

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Unter der Annahme, daß m min die minimale Anzahl Fluoreszenzmoleküle ist, die benötigt wird, um das Proteinmolekül zu detektieren, ist die gemessene Photonenemissionsrate durch

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gegeben. Das Proteinmolekül ist dann im Mittel solange sichtbar, bis das letzte der Δ m = m − m min Farbstoffmoleküle gebleicht ist. Nach den Gleichungen 2.35 und 2.37 ist dies gleich- bedeutend mit der Abnahme der Emissionsrate [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] Für die Sichtbar-keitsdauer des m -fach markierten Proteins folgt somit auf den Wert [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten]

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Man erhält das einfache, aber interessante Resultat, daß bei gleicher Anregungsintensität die Beobachtungsdauer eines m -fach markierten Proteins logarithmisch vom Markierungsgrad bzw. der Differenz zum Mindestmarkierungsgrad abhängt. Um eine Verdopplung der mittleren Sichtbarkeitsdauer bei m min = 1 zu erhalten, sind beispielsweise im Mittel 2,7 und bei einer Vervierfachung schon 20 Fluoreszenzmoleküle pro Protein notwendig. Je nach Protein und Farbstoff sind hohe Markierungsgrade experimentell nicht nur schwierig zu erzielen, sondern beeinflussen in der Regel auch die Funktion des markierten Proteins. Durch den reinen Markierungsgrad ist es demnach schwierig, die Sichtbarkeit zu verlängern.

Bei gleicher Fluoreszenzrate [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten], d.h. bei gleicher Signalintensität im Bild wie ein einzelnes Fluoreszenzmolekül, kann die Anregungsintensität I ill reduziert werden. Um welchen Betrag kann I ill aufgrund einer m -fachen Markierung reduziert werden, während die Emissionsrate dennoch konstant bleibt? Aus Gleichung 2.37 ergibt sich

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Eine Reduktion der Anregungsintensität verringert nach Gleichung 2.30 die Bleichrate und verlängert daher die mittlere Bleichzeit für jedes einzelne der m Moleküle entsprechend Gleichung 2.33. Die mittlere Bleichzeit und Sichtbarkeitsdauer für ein m -fach markiertes Proteinmolekül ist dann

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Die Sichtbarkeitsdauer ist demnach direkt proportional zur Differenz Δ m.

2.3.3 Anzahl der emittierten Photonen

Die mittlere Zahl der emittierten Photonen bis zur Photolyse ergibt sich nach Gleichung 2.38 zu

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