Estudio Químico y Electroquímico de Interacciones entre Biomoléculas y sus Aplicaciones en Biosensores

Biosensores - Caracterización y Desarrollo


Tesis Doctoral / Disertación, 2011
196 Páginas, Calificación: Sobresaliente

Extracto

Índice

FUNDAMENTOS TEÓRICOS
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Generalidades
1.2. Principio de operación
1.3. Ventajas y limitaciones
1.4. Antecedentes de sensores electroquímicos enzimáticos
1.5. Características e importancia del lactato
1.6. Objetivos
1.7. Hipótesis de trabajo
2. ENZIMAS
2.1. Actividad catalítica
2.2. Mecanismo de Michaelis Menten
2.3. Mecanismo de Ping-Pong para las enzimas rédox
2.4. Estabilidad
2.5. Enzimas inmovilizadas
2.6. Propiedades de las enzimas utilizadas
2.6.1. Lactato oxidasa
2.6.2. Glucosa oxidasa
3. SOPORTE DE LA ENZIMA
3.1. Clasificación y características generales
3.2. Propiedades de las matrices de hidrogel
3.2.1. Viscoelasticidad
3.2.2. Propiedades eléctricas
3.2.3. Hinchamiento
3.2.4. Coeficiente de distribución
3.3. Procesos de transporte en polímeros
3.4. Propiedades de los polímeros utilizados
3.4.1. Mucina
3.4.2. Albúmina
3.4.3. Carbopol
3.4.4. Quitosan
3.4.5. Mezclas de polímeros
3.5. Entrecruzamiento de la matriz
3.6. La membrana porosa
3.7. Membranas permeoselectivas

FUND AMENTOS METODOLÓGICOS
4. DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS
2.
3.
4.
4.1. Mediciones de reología
4.2. Estudios de impedancia electroquímica
4.3. Análisis del índice de hinchamiento
4.4. Determinación del coeficiente de distribución
4.5. Mediciones del coeficiente de difusión
4.6. Estudios de ángulo de contacto
5. CRONOAMPEROMETRÍA Y TÉCNICAS DE CÁLCULO
5.1. Introducción
5.2. Cronoamperometría
5.3. Respuesta electroquímica de biosensores
5.4. Desarrollo de ecuaciones numéricas para simular la respuesta del biosensor

SECCIÓN EXPERIMENTAL

6. MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES
6.1. Preparación de soluciones y materiales
6.2. Potenciostato, celda y electrodos del biosensor
6.3. Matriz enzimática y construcción del biosensor
6.4. Determinaciones realizadas por cronoamperometría
6.5. Estudio de propiedades fisicoquímicas

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
7. DESARROLLO DEL SENSOR PARA LA DETERMINACION DE LACTATO
7.1. Introducción
7.2. Efectos de las variables experimentales sobre la sensibilidad
7.2.1. Efecto del pH
7.2.2. Efecto de la fuerza iónica
7.2.3. Efecto de la composición de la matriz
7.2.4. Efecto de la concentración del agente entrecruzante
7.2.5. Comparación del efecto del agente entrecruzante sobre los sensores de glucosa y lactato.
7.3. Estudios de propiedades analíticas
7.4. Conclusiones parciales
8. ANÁLISIS DE INTERFERENTES Y ESTUDIOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
8.1. Caracterización de la membrana de nafion
8.2. Optimización de la respuesta a peróxido de hidrógeno
8.3. Bloqueo de la respuesta a ácido ascórbico
8.4. Aplicación de la membrana de nafion al biosensor de lactato
8.5. Efecto del nafion en la estabilidad del sensor
8.6. Ensayo de recuperación
8.7. Conclusiones parciales
9. EVALUACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DE LAS MATRICES POLIMERICAS
9.1. Índice de hinchamiento
9.1.1. Efecto de la composición
9.1.2. Efecto de la temperatura
9.2. Propiedades mecánicas – reología
9.3. Coeficiente de distribución
9.4. Permeabilidad
9.5. Espectroscopia de impedancia
9.6. Comparación de propiedades fisicoquímicas
10. MODELADO DEL BIOSENSOR DE LACTATO
10.1. Esquema general del biosensor de lactato
10.2. Diagrama y consideraciones del modelo numérico
10.3. Descripción de las ecuaciones del modelo numérico
10.4. Resultados de la simulación
10.5. Comparación de resultados experimentales con simulaciones
10.6. Introducción al modelado analítico del biosensor
10.7. Diagrama y consideraciones del modelo analítico
10.8. Descripción matemática del sistema
10.9. Análisis de la respuesta dinámica del sensor
10.9.1. Ecuación de la respuesta dinámica correspondiente a un único agregado de analito
10.9.2. Ecuación de la respuesta dinámica para múltiples agregados de analito
10.9.3. Ecuación límite a tiempo infinito
11. ANÁLISIS DE RESULTADOS EXPERIMENTALES CON EL MODELO
11.1. Determinación de la fracción oxidada
11.2. Efecto del espesor de membrana de policarbonato externa
11.3. Efecto del espesor de membrana de policarbonato interna
11.4. Efecto de la concentración de enzima
11.5. Efecto de la concentración de entrecruzante
12. COMPARACIÓN DE SENSORES DE GLUCOSA, LACTATO Y OXALATO UTILIZANDO EL MODELO ANALÍTICO
12.1. Introducción
12.2. Metodología y consideraciones
12.3. Comparación de la sensibilidad con la composición
12.4. Comparación de la respuesta dinámica
12.5. Correlación de propiedades fisicoquímicas y respuestas.
13. CONCLUSIONES GENERALES

Bibliografía

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

1.1. Generalidades

El biosensor es un dispositivo analítico que convierte un evento de reconocimiento biológico en una señal medible (1). Los biosensores están formados por tres componentes básicos, un elemento de biorreconocimiento, un transductor y un sistema de amplificación y procesamiento de la señal, figura 1.1.1 (1-4).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 1.1.1. Clasificación de Biosensores.

Cuando el elemento de biorreconocimiento entra en contacto con el analito se produce un cambio físico o químico que es detectado por el transductor a través de algún mecanismo y cuya respuesta es procesada y digitalizada para poder relacionarla de algún modo sencillo con la concentración del analito. Se han diseñado diferentes estrategias para inmovilizar al elemento de biorreconocimiento en (o cerca) de la superficie del transductor. Entre los más conocidos pueden citarse la unión covalente, la adsorción física, el atrapamiento y el entrecruzamiento (5). Este último combina a las estrategias de unión covalente y atrapamiento (5).

Tanto el elemento de biorreconocimiento como el mecanismo de transducción pueden variar de un biosensor a otro, lo que permite subdividirlos y clasificarlos de acuerdo a sus características específicas. Con respecto al elemento de biorreconocimiento los biosensores pueden clasificarse en: catalíticos o enzimáticos (2), de afinidad, los que a su vez se denominan inmunosensores si se emplean anticuerpos o haptenos (6), receptores de membrana y células (7), de hibridación (8), el cual involucra una etapa de reconocimiento en la que participan ácidos nucleicos y que es seguida por otra de amplificación usualmente enzimática, y elementos que involucran órganos, tejidos o incluso organismos enteros (9). En lo que respecta al mecanismo de transducción, los biosensores pueden clasificarse en: electroquímico, óptico, térmico y piezoeléctrico (4). En la figura 1.1.1 se muestra un esquema en donde se incluyen las clasificaciones de biosensores más conocidas (4, 10).

1.2. Principio de operación

En los biosensores electroquímicos enzimáticos (que es el caso de esta tesis), el analito interacciona con una enzima que está inmovilizada cerca o sobre la superficie del electrodo de trabajo (11). A partir de esta interacción se genera un producto electroactivo, cuya reacción electroquímica origina una corriente que es proporcional a la concentración del analito en la muestra analizada (12). En el caso de las enzimas tipo oxidasas, habitualmente éstas generan H2O2 entre sus productos. Esta molécula se puede oxidar sobre un electrodo de platino cuando este transductor se polariza a 0,65V vs. Ag|AgCl (electrodo de referencia de plata y cloruro de plata). También se puede emplear algún mediador rédox (por ejemplo ferroceno a 0,17V vs. Ag|AgCl), para poder trabajar a potenciales más bajos y de ese modo minimizar el efecto de posibles interferentes (10). La corriente eléctrica producida es amplificada y procesada por un circuito electrónico. Esta información puede mostrarse en una pantalla y acumularse en un dispositivo de memoria.

1.3. Ventajas y limitaciones

Los biosensores enzimáticos son excelentes dispositivos para la cuantificación de un variado número de moléculas. A continuación se mencionan algunas de sus ventajas y limitaciones.

Entre las virtudes se pueden considerar su:

Altísima selectividad. El elemento de biorreconocimiento es altamente específico ya que permite identificar a un dado analito en muestras muy complejas como sangre, suero, tejido, saliva, agua contaminada, etc. y distinguirlo de isómeros tanto estructurales como de estereoisómeros (13).

Capacidad de miniaturización. Se han desarrollado biosensores amperométricos utilizando ultramicroelectrodos y que tienen la capacidad de medir un dado analito en muestras tan pequeñas como una célula (14). También se pueden construir sistemas de medición portátiles que utilizan operacionales y microcontroladores para sustituir al transductor y a la computadora (15).

Bajo costo. A pesar de que en el laboratorio, el equipo de medición involucra generalmente a un potenciostato o a un espectrofotómetro conectado a una PC, los equipos comerciales generalmente tienen un costo mucho menor porque estos equipos se reemplazan por transductores de bajo costo conectados a amplificadores operacionales y microcontroladores (15).

Enzima reutilizable. Como la enzima se inmoviliza dentro del biosensor, se puede cuantificar la concentración del analito en múltiples muestras solamente introduciendo el sensor en cada una de ellas. Esto es una gran ventaja si se lo compara con lo que ocurre en ensayos con enzimas en solución, en las cuales la enzima utilizada para la determinación debe ser descartada por la imposibilidad de separarla de la mezcla de reacción (16).

Biocompatibilidad y capacidad de medición in vivo y a campo. Se pueden construir biosensores utilizando matrices biocompatibles y se han realizado experimentos donde funcionan directamente en el sistema circulatorio de animales de laboratorio (17). Existen biosensores desarrollados para medir en fuentes de agua natural, como es el caso de ríos, o contaminadas, como lo son los efluentes industriales. Estas características le permiten ser muy útiles en funciones de monitoreo y control (18, 19).

Bajo límite de detección. La sensibilidad de los biosensores es en general muy alta y no se requieren pasos de preconcentración de la muestra como ocurre en algunas determinaciones de laboratorio (20).

Alta estabilidad relativa. Durante el proceso de inmovilización se puede obtener una enzima más estable que la enzima libre en diferentes condiciones de reacción. Por esto, los sensores pueden responder adecuadamente en mayores intervalos de pH, fuerza iónica y temperatura (21).

Entre las deficiencias se pueden encontrar:

En el electrodo pueden reaccionar especies interferentes. La especificidad del biosensor está en la biomolécula, sin embargo también es probable que otras especies electroactivas que estén presentes en la muestra reaccionen directamente en la superficie del electrodo (12). Para evitar esto, se han desarrollado diferentes metodologías entre las que se encuentran la modificación de la superficie del electrodo utilizando membranas selectivas y el uso de intermediarios rédox con potenciales de oxidación menores que el de H2O2. Sin embargo, el uso de un mediador rédox generalmente restringe la vida útil del sensor debido a que habitualmente se pierde durante las etapas de funcionamiento o conservación (10).

Estabilidad limitada (con respecto a otros sensores). Si bien una vez que la enzima está inmovilizada es más estable que en una solución enzimática, en la actualidad se buscan sistemas que sean estables durante periodos de meses. A pesar de que existe un sinnúmero de estudios destinados a mejorar la sensibilidad y estabilidad de los biosensores, todavía se desconocen cuáles son las variables fundamentales que controlan la estabilidad operacional a largo plazo (20).

Poca reproducibilidad. El control de la composición y entrecruzamiento de la matriz y la enzima son claves para la obtención de sistemas reproducibles. Sin embargo, se acepta en general que los sensores son poco reproducibles por la gran cantidad de componentes que integran su estructura (22).

1.4. Antecedentes de sensores electroquímicos enzimáticos

Los biosensores electroquímicos enzimáticos, son de amplia difusión en la literatura (5, 23, 24). En estos casos, el elemento de biorreconocimiento está inmovilizado en la superficie del transductor mediante diferentes mecanismos: atrapamiento, adsorción física, entrecruzamiento o unión covalente (5). Este proceso de inmovilización no debe causar un cambio conformacional en el reactivo ni producir alteración del sitio activo tal que mantenga su especificidad. Además, es necesario que la matriz biológica tenga estabilidad y durabilidad (4).

Sin embargo, hay algunos aspectos referidos a la optimización de un sensor que deben ser considerados. La interfaz entre el detector y el transductor representa probablemente el mayor obstáculo en el desarrollo de un dispositivo práctico. Mejorar este aspecto, y lograr una integración total del sistema para una eficiente interacción entre muestra y sensor, son los intereses prioritarios en la actualidad. Los avances en las ciencias de materiales y las micro- y nano-tecnologías, han llevado a cambios importantes en la orientación de las investigaciones en esta área (4).

Con el objetivo de encontrar matrices enzimáticas que satisfagan estos requisitos, en nuestro grupo de investigación se trabaja desde hace algunos años en la búsqueda de condiciones óptimas de entrecruzamiento de enzimas con distintas proteínas biocompatibles para ser inmovilizadas en sensores amperométricos. Se estudiaron las propiedades fisicoquímicas de diferentes matrices y se correlacionaron con la respuesta electroquímica del sensor (25).

En particular, se ha trabajado en un biosensor de oxalato (25, 26) con matrices resultantes de la mezcla de mucina y carbopol en diferentes proporciones. Se analiza las mezclas físicas y entrecruzadas empleando glutaraldehído como agente entrecruzante (26).

La mucina es una glicoproteína altamente biocompatible que se comporta como polielectrolito aniónico debido a los grupos sulfato y derivados del ácido siálico (pKa= 2,6) (27). El carbopol es un polímero del ácido poliacrílico cuyos grupos -COOH están parcialmente disociados a los pH de trabajo resultando en una estructura altamente flexible y reconocida por sus propiedades mucoadhesivas (28). La interpenetración y entrecruzamiento entre los grupos funcionales de ambos polímeros da como resultado mezclas con gran sinergismo reológico responsable de la mayor estabilidad de la mezclas (29).

Trabajos posteriores del grupo incluyeron al quitosán como sustituto del carbopol en mezclas con mucina para inmovilizar la enzima oxalato oxidasa (pH=2,8) y glucosa oxidasa (pH=7,0), con excelentes resultados (30). El quitosán es un polímero derivado de la quitina cuyos grupos aminos protonados le otorgan una importante densidad de carga positiva a pH ácidos. La presencia de cargas opuestas entre la matriz y el analito modifican la permeabilidad y la distribución de especies dentro del sensor (30). Estos estudios permitieron concluir que la estructura y las propiedades de la matriz polimérica pueden afectar la respuesta del sensor también por cambios en la permeabilidad a las especies involucradas en la detección y no sólo influyendo en las condiciones de inmovilización.

Se ha demostrado que la copolimerización es un buen método para cambiar las propiedades de los polímeros, permitiendo controlar la estabilidad térmica, la solubilidad, la conductividad eléctrica, la formación de películas estables, la permeabilidad el hinchamiento, etc. (31). De esta manera, considerando la influencia de factores como el pH, fuerza iónica, conductividad, sinergismo reológico y la composición de la matriz, surge el interés de utilizar otros polímeros para la inmovilización de la enzima. La albúmina es una proteína cuyo punto isoeléctrico es 4,9 y se encuentra cargada negativamente a pH=7,0. Ha sido utilizada para el desarrollo de biosensores con excelentes resultados (32). Aunque en el grupo se demostró que no posee propiedades mecánicas adecuadas cuando se utiliza sin combinarla con otras matrices (25).

También se puede considerar variar el elemento de biorreconocimiento para una dada matriz y extender el uso de la matriz mucina /carbopol para inmovilizar enzimas que funcionen bajo diferentes condiciones; por ejemplo lactato oxidasa (pH óptimo =7,0) en lugar de oxalato oxidasa que tiene su mejor respuesta a pH=2,8 para esta matriz. Se han descripto numerosos sensores de lactato como consecuencia de la importancia de su determinación ya que es un excelente indicador del estado de oxigenación de los tejidos (33). En este sentido, distintos autores continúan tratando de lograr condiciones óptimas de inmovilización, dado que por las características del sensor, es importante lograr gran biocompatibilidad y estabilidad para su uso en muestras biológicas (34).

1.5. Características e importancia del lactato

Fisiopatología del lactato. El lactato es la especie aniónica proveniente de la deprotonación del carboxilo del ácido láctico (Figura 1.5.1), el cual tiene un pKa = 4,19. En el cuerpo humano, el L-lactato se produce a partir de la acción de la enzima lactato deshidrogenasa sobre el ácido pirúvico. Nótese que posteriormente se nombrará al lactato haciendo referencia al L-lactato.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 1.5.1. Diagrama tridimensional de una molécula de ácido L-láctico. Los colores representan los distintos átomos que lo componen. C (negro), H (gris) y O (rojo).

El lactato se produce y consume constantemente durante los procesos metabólicos; en humanos la concentración basal es de 1 a 2 mM. Sin embargo, la concentración puede incrementarse fisiológicamente a causa de ejercicio intenso o patológicamente por diversas enfermedades (35).

Durante la actividad física, la contracción muscular consume moléculas de adenosín trifosfato (ATP) el cual se produce principalmente a través de la vía aerobia. Cuando el ejercicio es intenso, la cantidad de energía requerida por el músculo se incrementa significativamente y a pesar de que también se incrementa el ritmo cardíaco y ventilatorio, el aporte de oxígeno de la sangre no puede aumentar en la misma proporción. Bajo estas circunstancias, la disponibilidad de oxígeno es escasa, la glucosa es metabolizada anaeróbicamente hasta piruvato y en la forma reducida de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH), los cuales no pueden continuar la vía aerobia en la mitocondria. En esta etapa, la enzima lactato dehidrogenasa se encarga de reducir el piruvato a lactato y de oxidar el NADH a NAD+. El NAD+ permite continuar con la glucólisis anaerobia, y por consiguiente, con la producción de ATP en el tejido muscular. El exceso de lactato en el músculo se elimina mediante su difusión hacia la sangre. La cuantificación de lactato antes y después del ejercicio permite evaluar la capacidad respiratoria muscular de un individuo.

La anoxia, producto de enfermedades como la neumonía e insuficiencia cardiaca congestiva, es una de las patologías más frecuentes por la que se suelen elevar las concentraciones de lactato y piruvato en sangre. La acidez láctica se produce además por deficiencias renales y leucemia. La deficiencia de tiamina, cetoacidosis diabética (35) e intoxicación por etanol también muestran cierto incremento de lactato y piruvato. En el líquido cefalorraquídeo aumenta el nivel de lactato en la meningitis bacteriana, lo que no se observa en la meningitis viral. También se incrementa en casos de pacientes con hipocapnia, hidrocefalia, abscesos cerebrales, isquemia cerebral y otras condiciones clínicas asociadas con la reducida oxigenación y aumento de la presión intracraneana (36).

Posibles Aplicaciones. Hay muchas aplicaciones para las cuales se puede utilizar la determinación de lactato, por ejemplo en la evaluación del estado atlético de deportistas sobre todo a nivel profesional (37), en la industria alimenticia (38) y en el área clínica (39).

Uno de los usos más importantes es en pacientes hospitalizados que se encuentran en estado de coma y no disponen de automatismo respiratorio. En estos individuos la ventilación se realiza mecánicamente y se calcula aproximadamente cual es la frecuencia y concentración de oxígeno administrada mediante el uso de un oxímetro infrarrojo. Las mediciones de lactato realizadas hace algunos años en la terapia intensiva del Hospital de Clínicas (40) indicaron que, aunque la presión parcial de los gases en sangre (PaO2 y PaCO2) se encuentren dentro de los valores de referencia (80-100 y 35-45mmHg respectivamente) y el oxímetro muestre que la saturación de oxígeno de la sangre es normal (95-100%), es posible que la oxigenación sea deficiente a nivel tisular, lo cual representa un alto riesgo para la vida del individuo. Lamentablemente, el método enzimático que se utilizaba en esa oportunidad no permitió hacer el seguimiento con la frecuencia necesaria, debido a que la cuantificación de lactato era muy costosa. Esto podría ser resuelto utilizando un sistema de medición más económico, rápido y de sencilla manipulación que le permita al personal médico controlar más eficientemente el nivel de ventilación requerido por el paciente. El sistema de medición que cumple con estos requisitos podría ser un biosensor amperométrico de lactato.

1.6. Objetivos

Objetivos generales:

- Desarrollar y caracterizar un biosensor electroquímico para la detección de lactato en muestras de sangre entera.

- Estudiar las propiedades fisicoquímicas de las matrices empleadas en la inmovilización enzimática y correlacionarlas con la respuesta cronoamperométrica del biosensor.

Objetivos específicos:

- Modificar matrices utilizando albúmina, mucina, carbopol y quitosan para formar hidrogeles en los que se pueda inmovilizar a la enzima lactato oxidasa, y que además permitan optimizar el funcionamiento del biosensor.

- Desarrollar modelos matemáticos para simular las respuestas experimentales y de este modo efectuar una mejor evaluación de las variables de cada sistema.

- Hacer un análisis comparativo con otros biosensores.

1.7. Hipótesis de trabajo

En esta tesis se desean establecer relaciones entre las respuestas de sensores amperométricos enzimáticos y las propiedades fisicoquímicas del sistema. Por consiguiente, no sólo se busca analizar el efecto de aquellas variables experimentales que permitirían optimizar la respuesta analítica de un biosensor enzimático, sino también identificar funciones y variables que ayuden a comprender por qué ocurren ciertos cambios en la señal cuando se modifica la composición y/o construcción del biosensor.

Inicialmente, se conocía que la matriz influía en forma significativa y compleja sobre la respuesta del sensor, ya que afectaba directamente a la actividad de una dada biomolécula (25). A raíz de esto, se consideró que era indispensable diseñar experimentos que permitan discriminar la influencia de los procesos individuales para poder caracterizar e identificar a las variables que controlan al sistema. Una vez realizadas estas mediciones sería necesario establecer relaciones que ayuden a entender el efecto de cada variable sobre el funcionamiento global del sensor. Además de estas relaciones, se debería contar con modelos teóricos que puedan simular las respuestas experimentales. Esto permitiría comprender más fácilmente cómo los cambios en las propiedades fisicoquímicas del sistema afectan a parámetros analíticos como la sensibilidad, tiempo de respuesta y estabilidad del biosensor. Para lograr esto, se planea evaluar cómo cambian la viscoelasticidad, permeabilidad, conductividad y capacidad de hinchamiento de la matriz en función de los distintos componentes de la misma y relacionarlos mediante ecuaciones numéricas y/o analíticas con los cambios que resulten en los parámetros analíticos del biosensor.

CAPÍTULO 2. ENZIMAS

2.1. Actividad catalítica

Los catalizadores son sustancias que modifican la cinética de un proceso químico disminuyendo la energía de activación por medio de la generación de un estado de transición diferente. Si bien no forman parte de la reacción química global, componen el complejo activado y se regeneran al final del proceso. No cambian el rendimiento de una reacción química pero pueden hacer que ocurra a menores temperaturas.

Las enzimas son catalizadores biológicos que actúan a través de cambios conformacionales o polarizaciones producidos por la interacción con el sustrato llevando al complejo activado a un estado de mayor reactividad con una conformación similar al estado de transición. El uso de enzimas en lugar de cualquier catalizador inorgánico para la construcción biosensores se debe a la alta especificidad que tienen por el analito (41).

2.2. Mecanismo de Michaelis Menten

El mecanismo aceptado para el caso de un solo reactante y un solo producto fue propuesto por Michaelis-Menten (42) y es el siguiente:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde E es la enzima, S es el sustrato, ES es el complejo enzima-sustrato y P el producto. Además, es probable que haya un mecanismo no catalizado que se produce al mismo tiempo pero con una velocidad despreciable.

La utilización del estado estacionario para obtener la ley de velocidad del mecanismo de Michaelis-Menten fue desarrollada por Briggs y Haldane (43).

Se considera que la enzima alcanza rápidamente el estado estacionario en el cual la concentración de complejo enzima-sustrato [ES] es constante con el tiempo, es decir:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde [E] es la concentración de enzima, [S] la de sustrato y [P] la de producto.

El cambio de la concentración de producto es de primer orden respecto de la concentración del complejo [ES]:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Sin embargo, la concentración de enzima no combinada [E] y la combinada [ES] son desconocidas, siendo [E]T la concentración total de enzima:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Debido a que la concentración de reactante es mayor que la concentración de enzima y por lo tanto mucho mayor que [ES], la concentración de sustrato libre [S], puede ser considerado aproximadamente igual a la concentración total de sustrato [S]T:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Suponiendo que la ecuación 2.2.2 se cumple, se puede obtener [ES]. Luego se reemplaza en esta ecuación [E] por ([E]T-[ES]) y [S] por [S]T según la ecuación 2.2.4 y 2.2.5 respectivamente y se obtiene:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Para deducir la ecuación de velocidad, se combinan las ecuaciones 2.2.3 y 2.2.6. Además, se incorpora la constante de Michaelis-Menten (Km) que equivale a (K2+K-1)/K1, la velocidad máxima (vmax) se reemplaza por K2 [E] y se obtiene la ecuación de velocidad:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 2.2 . En el gráfico se muestra la respuesta de una enzima de cinética michaeliana. Las flechas indican los valores que corresponden a v máx y K m.

Como puede observarse de la figura 2.2, la constante de Michaelis-Menten (Km) puede interpretarse como la concentración necesaria para que la velocidad de catálisis enzimática alcance la mitad de la velocidad máxima (vmax) y además brinda información acerca de la afinidad de la enzima por el sustrato; un valor pequeño de Km indica alta afinidad (44).

2.3. Mecanismo de ping-pong para las enzimas rédox

Muchas de las reacciones enzimáticas involucran dos o tres sustratos o productos. Si alguno de los productos es liberado antes de la unión de la enzima con otro de los sustratos el mecanismo se denomina ping-pong (41). El análisis del estado estacionario para una reacción de dos sustratos, procede de la misma manera que para una reacción de un solo sustrato.

En este mecanismo, el paso “ping” es la reacción del primer sustrato con la enzima, la transformación química de esta última y la liberación del primer producto.

En el paso “pong”, el segundo sustrato reacciona con la enzima modificada químicamente para generar el segundo producto y regenerar la enzima original.

El mecanismo de ping-pong ocurre en reacciones dependientes de coenzimas, en el cual la función de éstas es facilitar la transferencia de un grupo funcional de un sustrato a otro.

Las ecuaciones del mecanismo son las siguientes:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

En donde E y F son dos formas de la misma enzima, A y B son los sustratos y, P y Q son los productos.

La ecuación de velocidad que se obtiene es la que se presenta a continuación:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde KmA= K7(K2+K3)/K1(K3+K7); KmB=K3(K6+K7)/K5(K6+K3); v1=K3K7/(K3+K7)[E]

En esta tesis, se utilizaron enzimas rédox que funcionan mediante este mecanismo; sin embargo, dada las condiciones del biosensor utilizado se puede considerar despreciable el efecto del segundo sustrato (B) en el control de la velocidad por lo que se utiliza una ecuación con la forma de Michaelis-Menten (2.2.7). La justificación del uso de esta aproximación, se explica en detalle en el capítulo 10.

2.4. Estabilidad

La estabilidad de una proteína se relaciona con la resistencia a la desnaturalización y a la inactivación. La desnaturalización es el desenrollamiento de la estructura terciaria de una proteína para formar un polipéptido desordenado que no puede cumplir con su función biológica; este proceso puede ser revertido cuando se elimina la influencia del desnaturalizante.

La inactivación es un proceso irreversible de pérdida de actividad por la acción de agentes químicos. También lo es la disociación de subunidades de una enzima multimérica. La estabilidad cinética o de largo plazo, da cuenta de la retención de la actividad biológica por la resistencia a la inactivación irreversible.

Es importante aclarar que ambos procesos no son independientes, y se entiende generalmente que un proceso de inactivación tiene varias etapas que comienzan con la desnaturalización. Los agentes desnaturalizantes más importantes son la temperatura, el pH, agentes químicos, proteasas y fuerza iónica.

Una forma de comprender cuales son las variables más importantes que determinan la estabilidad, consiste en comparar el comportamiento de la misma enzima en organismos adaptados a condiciones muy diferentes, por ejemplo entre organismos mesófilos (adaptados a vivir a temperatura ambiente) y organismos extremófilos (adaptados a condiciones extremas de temperatura, fuerza iónica, etc.). En general, se observa que las enzimas extremófilas tienen una menor tendencia al desenrollamiento a causa de un mayor número de interacciones intramoleculares y son más rígidas que las enzimas mesófilas. Como consecuencia de la pérdida de la flexibilidad, tienen una menor actividad catalítica.

Entre los métodos artificiales de estabilización más usados, se encuentran la modificación genética, química, el uso de aditivos y la inmovilización en un soporte. La modificación genética puede ser orientada, por ejemplo introduciendo cisteína en sitios que propicien puentes disulfuros intramoleculares o al azar, mediante mutaciones y selección de mutantes. La modificación química se puede lograr cambiando el grupo funcional de los residuos laterales, con agentes entrecruzantes o mediante injertos de cadenas de polisacáridos. Los aditivos, en general, pueden mejorar la estabilidad pero habitualmente interfieren en la reacción de catálisis enzimática. Algunos de ellos son el ligando de la enzima, sales inorgánicas, carbohidratos, glicerol, polietilenglicol y dimetilsulfóxido.

El método más usado de estabilización, es la inmovilización de la enzima en un soporte, lo que le otorga protección, estabiliza mecánicamente las cadenas por los puntos de anclaje y evita la agregación (45,46). Por otro lado, posee la desventaja de limitar la difusión y en algunos casos producir pérdida de actividad (45,46).

2.5. Enzimas inmovilizadas.

Existen varias metodologías para la inmovilización de enzimas (2), las cuales pueden clasificarse de la siguiente forma (47):

I) Inmovilización reversible
- Adsorción
- Bioafinidad
II) Inmovilización irreversible
- Covalente
- Atrapamiento y microencapsulación

Cuando la enzima se inmoviliza de manera reversible, puede ser liberada del soporte sin afectar significativamente su actividad. Tiene la ventaja de que no requiere modificación química de la enzima y que las condiciones de anclaje son mucho más benignas comparadas con los métodos irreversibles. Esta metodología se utiliza en sistemas donde la muestra contiene las enzimas y se requiere medir la concentración de éstas o cuando el soporte es más caro que la enzima. La elevada actividad remanente, permite obtener altas velocidades de conversión con bajas concentraciones de la biomolécula. Los biosensores obtenidos con estos métodos tienen alta sensibilidad pero baja estabilidad.

Los métodos irreversibles, permiten retener la molécula enzimática dentro del soporte y para retirarla son necesarias condiciones lo suficientemente drásticas que pueden comprometer la actividad de la enzima y causar la inactivación.

El atrapamiento involucra la captura del biocatalizador en una red tridimensional de polímero y se puede realizar polimerizando monómeros en presencia de la enzima o mezclando ésta con cadenas libres de polímero, para generar posteriormente las uniones entre las cadenas.

La formación de enlaces covalentes entre los aminoácidos superficiales y la matriz insoluble es también muy utilizada como método de inmovilización. Los aminoácidos que participan en general son los más polares, tales como la lisina (a través de los grupos aminos) y la cisteína (por los grupos -SH). Generalmente, la reacción se produce a través de una especie que hace de “puente” entre la enzima y el soporte. El control de las condiciones del ensayo es crítico para la retención de actividad.

Si bien la actividad remanente es baja, este método es ampliamente utilizado para el desarrollo de sensores, debido a que la enzima retenida en el soporte es estable y más resistente a cambios en las condiciones del entorno respecto a la unida reversiblemente. La respuesta analítica es confiable porque se elimina el problema causado por la difusión constante de la enzima desde la matriz a la solución.

La disminución de los grados de libertad de las moléculas unidas covalentemente a la red incrementa su estabilidad porque evita que se desenrollen las cadenas y la agregación ocasionada por la interacción entre moléculas enzimáticas.

En este trabajo, la enzima se inmovilizará utilizando glutaraldehído como agente entrecruzante, el cual reacciona predominantemente con los grupos aminos de la cadena lateral de los aminoácidos lisina (48). La posición y cantidad de lisina en la secuencia de la proteína, podrían determinar la sensibilidad de la enzima a la reacción de entrecruzamiento.

2.6. Propiedades de las enzimas utilizadas

2.6.1. Lactato oxidasa

(LOD). En los experimentos se utiliza la enzima producida por el microorganismo Aerococcus Viridians. La enzima LOD cataliza la oxidación de lactato a piruvato y peróxido de hidrógeno utilizando el grupo prostético flavina mononucleótido (FMN).

En la figura 2.6.1.1 se muestra la estructura molecular de las flavinas. Estas tienen un anillo común de isoaloxacina y una cadena lateral unida al nitrógeno N10 en la cual el grupo A diferencia los distintos tipos de flavina. La FMN tiene un grupo fosfato en esa posición. Los nitrógenos N5 y N1 aceptan o ceden protones y definen el estado de oxidación de la molécula.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 2.6.1.1. Esquema de la estructura de las flavinas en estado oxidado y reducido. De acuerdo al grupo A, la molécula puede ser riboflavina, flavina mononucleótido (FMN) o flavina adenina dinucleótido (FAD) (41) .

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde LODox y LODred son las formas oxidadas y reducidas de la enzima, Lac es el primer sustrato, lactato, y Pir el primer producto, piruvato.

La reacción procede vía un mecanismo ping-pong con pasos reductivos secuenciales y oxidativos. La ecuación de velocidad del mecanismo es (49):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde KmLac es equivalente a KmA y KmO2 a KmB de la ecuación 2.3.2.

El modelo más ampliamente aceptado, involucra la abstracción del protón del sustrato por una base adyacente para generar un carbanión, seguido de la transferencia de dos electrones al cofactor. Un modelo alternativo, involucra la transferencia de un ión hidruro desde el sustrato al átomo N5 del cofactor.

Estructura Molecular. En la figura 2.6.1.2 se muestra la estructura de LOD obtenida por difracción de rayos X con una resolución de 2,1Å (50). La enzima LOD cristaliza en dos tetrámeros altamente empaquetados en la unidad asimétrica.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 2.6.1.2. Estructura cristalográfica de la enzima LOD obtenida por difracción de rayos X.

En la figura 2.6.1.3 se muestra la estructura de cada tetrámero y sus dimensiones aproximadas. Cada tetrámero constituye una unidad biológicamente activa. En el interior de cada una de las subunidades se encuentra el cofactor FMN.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 2.6.1.3. Estructura cristalográfica de un tetrámero de LOD. Los círculos indican la posición del cofactor flavina mononucleótido (FMN) en cada subunidad y las líneas las dimensiones aproximadas (Armstrong).

Cada subunidad tiene 374 aminoácidos y está enrollada en un barril a /b con dos cadenas b localizadas en el fondo del barril y el carbono terminal orientado hacia el poro central del tetrámero. El monómero contiene 15 a-hélices de varios tamaños. El sitio de unión de FMN y el sitio activo están ubicados en el lado C terminal del barril b donde los aminoácidos forman una estructura con forma de tapa.

El sitio activo de flavina mononucleótido (FMN), está posicionado detrás y en lo profundo del conducto de unión del sustrato. En los ocho monómeros, la FMN esta inclinada cerca de 15° alrededor de los átomos centrales, dando al grupo FMN una forma de U. La estructura tiene una coordinación conservada de FMN, pero también revela nuevos residuos involucrados en la unión al sustrato comparado con otros miembros de la familia. La enzima posee además un sitio de alta afinidad al zinc.

La LOD puede ser entrecruzada con el glutaraldehído a través de los grupos aminos presentes en los aminoácidos lisina (lys) de la secuencia de la enzima. La LOD posee 160 aminoácidos lys (5,3% respecto del total). Cabe destacar que la lys241 forma parte del sitio catalítico (51).

2.6.2. Glucosa oxidasa

(GOD). La b-D-glucosa: oxígeno 1-oxidoreductasa o glucosa oxidasa se puede obtener comercialmente del organismo Aspergillus Níger. Esta enzima es una glicoproteína que contiene residuos de manosa unidos por enlaces O-glicosídicos o N-glicosídicos y N-acetilglucosamina (NAG). Está constituida por dos subunidades cada una de las cuales incorpora como grupo prostético flavina adenina dinucleótido (FAD), como se muestra en la figura 2.6.1.1.

Mecanismo de acción: La reacción se produce mediante un mecanismo ping-pong con una etapa de oxidación y una de reducción.

La hemirreacción de reducción ocurre por un mecanismo en el que la b-D-glucosa es oxidada a glucono-d-lactona mediante transferencia concertada de un protón a la histidina-516 y un hidruro a la posición N-5 del FAD.

La hemirreacción oxidativa procede mediante un mecanismo de transferencia de uno o dos electrones dependiendo del tipo de sustrato oxidante. Si el oxígeno molecular es el sustrato, la coenzima reducida FADH- es reoxidada a FAD transfiriendo dos electrones al oxígeno molecular el cual se reduce a peróxido de hidrógeno (Figura 2.6.2.1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 2.6.2.1. Mecanismo de reacción de la enzima glucosa oxidasa

Estructura Molecular: Las subunidades de la enzima GOD se enlazan covalentemente por un puente disulfuro, tienen 583 aminoácidos y un peso molecular de unos 80 kDa cada una. El sitio activo tiene siete aminoácidos, de los cuales tres determinan la orientación correcta del sustrato: tyr-73, phe-418 y trp-430; dos contribuyen a la unión eficiente del sustrato: arg-516 y asn-518; y los últimos estabilizan la unión enzima sustrato mediante puentes hidrógeno: his-520 y his-563. Hay tres aminoácidos que disponen sus cadenas laterales hacia el sitio activo: glu-412, his-516 y his-559.

En la figura 2.6.2.2 se muestra la estructura cristalográfica de GOD parcialmente deglicosilada, obtenida por difracción de rayos X con una resolución de 1,9Å (52) y se indica con un círculo la posición aproximada del cofactor FAD.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 2.6.2.2. Estructura cristalográfica de una subunidad de la enzima glucosa oxidasa parcialmente deglicosilada. El círculo muestra la posición aproximada del cofactor FAD.

De la misma manera que la LOD, la GOD puede ser entrecruzada a través de los aminoácidos lisina (lys) de la secuencia de la enzima. La GOD posee 30 lys (2,6% respecto del total) pero ninguno de esos aminoácidos forma parte del sitio catalítico (51).

CAPÍTULO 3. SOPORTE DE LA ENZIMA

3.1. Clasificación y características generales

La función de la matriz polimérica es inmovilizar el elemento de biorreconocimiento evitando en lo posible causar cambios conformacionales que puedan alterar el sitio activo. La mayor parte de las matrices que cumplen adecuadamente esta tarea son hidrofílicas; contienen grandes cantidades de agua en una estructura tridimensional formada por polímeros entrecruzados constituyendo los hidrogeles. La unión entre cadenas poliméricas impide el desenrollamiento (por solvatación), razón por la cual estos tipos de hidrogeles son insolubles.

Los hidrogeles se pueden clasificar según el origen en naturales, sintéticos o semisintéticos; de acuerdo a los tipos de grupos funcionales expuestos en iónicos o neutros; según la morfología de la red polimérica en amorfos y semicristalinos; y de acuerdo a la estructura de la red en macroporosos, microporosos y no porosos.

Para la construcción de soportes enzimáticos se utilizan geles naturales, sintéticos o semisintéticos. En esta tesis se utilizaron polímeros naturales como la mucina y la albúmina. También se emplearon con fines comparativos polímeros como el quitosán y geles sintéticos como el carbopol. Todos estos polímeros se entrecruzaron con glutaraldehído para formar los distintos hidrogeles empleados en la construcción de biosensores.

Los hidrogeles entrecruzados suelen ser débiles mecánicamente y pueden resultar afectados durante la manipulación, por eso es necesario protegerlos con un material más resistente mecánicamente. Es útil emplear una membrana a cada lado de la matriz y a esta configuración se la denomina sándwich.

En los biosensores, la matriz enzimática puede estar acompañada de una membrana permeoselectiva con el fin de evitar el efecto de interferentes. El nafion es un fluoropolímero sulfonado (53) que se emplea con este propósito en los sensores estudiados.

A continuación se detallan algunas propiedades de las matrices de hidrogel que sirvieron para caracterizar el funcionamiento de biosensores.

3.2. Propiedades de las matrices del hidrogel

3.2.1 Viscoelasticidad:

Es el término que sirve para definir la coexistencia de propiedades viscosas (líquidas) y elásticas (sólidas) de los materiales (54). La viscoelasticidad se puede comprender mejor al analizar los casos más simples, el sólido ideal y el líquido ideal.

El comportamiento viscoelástico o reológico de sólidos ideales es descrito matemáticamente por la ley de Hooke, la cual establece que la deformación de una muestra es directamente proporcional al estrés aplicado a un material sólido. Éste representa la fuerza (F) aplicada por unidad de área inicial (A0) lo cual puede producir una deformación que consiste en el cambio de dimensiones respecto de la condición inicial de la muestra.

Se pueden aplicar dos tipos principales de estrés a un material, el estrés de tracción (s) (elongación) y el estrés de corte (t), los cuales se diferencian por la dirección en la que se aplica la fuerza. Se analizarán estos dos casos sobre una muestra hipotética de geometría cuboide (figura 3.2.1.1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 3.2.1.1. Estrés y deformación de una muestra cuboide a) de tracción b) de corte

El módulo de tracción o de Young (E) es el cociente entre el estrés de tracción (s) y la deformación de tracción (e), de acuerdo a la siguiente expresión:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde la fuerza aplicada es normal al plano de la superficie fija de la muestra (figura 3.2.1.a).

El módulo de corte (G), por otro lado, se calcula como la relación entre el estrés de corte (t) y la deformación de corte (g). El estrés de corte (t) se puede considerar como la aplicación de una fuerza paralela a la normal, que causa una deformación en la muestra que desplaza una cara respecto de otra un ángulo a (figura 3.2.1.1 b). La tangente del ángulo a es la deformación (g). En la ecuación se muestra el cálculo del modulo de corte (G):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Si el ángulo es pequeño se puede aproximar tan a ≈ a, lo que resulta:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Es de destacar que los sólidos ideales recuperan completamente la forma luego de que desaparece la aplicación del estrés (figura 3.2.1.2):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 3.2.1.2. Respuesta elástica de un sólido ideal.

Cuando se supera el límite elástico del material sólido ocurren desviaciones de la idealidad.

Para los líquidos ideales (newtonianos), el estrés de corte aplicado sobre una muestra es proporcional a la velocidad de deformación (gradiente de velocidad), y la constante de proporcionalidad es la viscosidad. Por lo tanto, la respuesta de los líquidos ideales a un estrés aplicado es dependiente del tiempo (es dependiente de la velocidad de deformación y no de la deformación en sí misma) como se observa en la ecuación 3.2.1.4:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthaltenes la velocidad de deformación de corte y h la viscosidad de corte.

La figura 3.2.1.3 a) muestra el estrés de corte (t) en función de la velocidad de deformación (Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten) y b) muestra el logaritmo de la viscosidad de corte en función del logaritmo de la velocidad de deformación (Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten), para líquidos newtonianos.

Figura 3.2.1.3. a) Estrés de corte vs. velocidad de deformación y b) logaritmo de la viscosidad vs. logaritmo de la velocidad de deformación para líquidos Newtonianos.

Las desviaciones de la idealidad en líquidos ocurren cuando la relación entre el estrés y la velocidad de deformación son no lineales.

En definitiva, los cuerpos sólidos ideales tienen la capacidad de acumular la energía y usarla para recuperarse de la deformación causada por el estrés aplicado, mientras que los líquidos disipan la energía aplicada como calor y son incapaces de recuperar su estructura.

La mayoría de los compuestos poliméricos se comportan de manera que sus propiedades combinan la respuesta elástica (sólida) y viscosa (líquida) y por lo tanto, el estrés aplicado es proporcional a la deformación y a la velocidad de deformación.

Los sistemas viscoelásticos predominantemente sólidos se caracterizan por no mantener una deformación constante ante la aplicación de un estrés constante. Lo que ocurre es que el material continúa deformándose con el tiempo; a este fenómeno se lo denomina deslizamiento (figura 3.2.1.4).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 3.2.1.4. Deformación característica (deslizamiento) de sólidos viscoelásticos en función del tiempo.

En cambio, los líquidos viscoelásticos pueden acumular una parte de la energía aplicada y usarla para recuperar parcialmente la forma de la deformación inducida por el estrés.

De acuerdo a sus propiedades viscoelásticas, los geles poliméricos se pueden clasificar en tres clases principales: materiales covalentemente entrecruzados, redes enrolladas y geles físicos

Los materiales covalentemente entrecruzados se forman por entrecruzamiento de cadenas de alto peso molecular o polimerización de precursores multifuncionales. Estos materiales son verdaderas moléculas de peso molecular cercano a infinito. El tiempo de relajación es el tiempo necesario para que una cadena perturbada se relaje aproximadamente a un tercio del estado inicial. Durante la gelificación el tiempo de relajación tiende a infinito y los módulos elásticos y viscosos están en equilibrio (son independientes de la frecuencia).

Las redes enrolladas están formadas por la simple interacción topológica de cadenas poliméricas. Además, pueden disolverse en exceso de solvente, lo que no ocurre en geles entrecruzados. Las redes enrolladas fluyen como líquidos de alta viscosidad a muy bajas frecuencias de perturbación.

Los geles físicos son redes entrecruzadas por uniones no covalentes de baja energía. El número de enlaces y la posición dependen del tiempo y de la temperatura. Las uniones no covalentes pueden ser coulómbicas, dipolo-dipolo, de Van der Waals, transferencia de carga, hidrofóbicas, puente hidrógeno, etc. La gelatina es un ejemplo de este tipo de geles. Los geles físicos se clasifican en fuertes y débiles. Ambos se caracterizan por responder como sólidos a pequeñas deformaciones. Los geles fuertes son sólidos a grandes deformaciones mientras que los geles débiles son fluidos estructurados y fluyen como líquidos.

3.2.2 Propiedades eléctricas.

La separación de carga dentro de una molécula permite la generación de un momento dipolar. Las cargas responsables de este momento dipolar pueden ser independientes de factores externos y se denominan permanentes. También pueden ser inducidas por la presencia de un campo eléctrico. De todas maneras, las cargas tendrán tendencia a responder al campo para reducir la energía libre del sistema a un mínimo (55). La aplicación de un campo eléctrico en una muestra produce una corriente eléctrica. La impedancia es la oposición que presenta la muestra a la circulación de la corriente eléctrica.

La impedancia Z es un número complejo definido como la relación entre la tensión aplicada V sobre una muestra y la corriente I que circula a través de la misma. Para una muestra homogénea e isótropa, es función de la conductividad s y permitividad er, como se muestra en la ecuación 3.2.5:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde k es la constante de celda, j es el símbolo imaginario, w la frecuencia y eo la permitividad en el vacío.

La aplicación de un campo eléctrico causa el establecimiento de cargas inducidas y la reorientación de dipolos. Las matrices poliméricas se pueden imaginar como dipolos que se reorientan si son sometidas a un campo eléctrico, generando una corriente de polarización (55). Hay modelos que consideran que la impedancia de la muestra puede representarse mediante un circuito equivalente constituido por dos elementos en serie (56), uno que se manifiesta a altas frecuencias (R1 y C1) y otro a bajas frecuencias (R2 y C2) como se muestra en el esquema eléctrico de la figura 3.2.5. Según este modelo, desarrollado por Maxwell y Wagner, la muestra estaría constituida por dos capas y cada una de ellas está representada eléctricamente por los elementos mencionados.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 3.2.5. Circuito equivalente de un polímero basado en un modelo de dos capas.

El elemento de alta frecuencia representa la conductividad en el seno de la muestra. Los elementos de baja frecuencia reflejan el comportamiento de una capa de muestra adsorbida en la superficie del electrodo. Esta superficie actúa como una capa de bloqueo al transporte de cargas. La capacitancia cambia poco con la frecuencia y se puede considerar como un capacitor donde la carga se acumula (56). Esta dependencia del comportamiento eléctrico con la frecuencia de la perturbación eléctrica aplicada constituye el fundamento de estas técnicas. Para estudiar el comportamiento eléctrico de la muestra se utiliza la técnica denominada espectroscopia de impedancia electroquímica la cual se detalla en el capítulo 4.

El estudio de propiedades eléctricas se ha utilizado para la caracterización de sensores en presencia de concentraciones crecientes de analito (57). Los cambios en las propiedades eléctricas de matrices poliméricas, pueden asociarse a reacciones de oxidación, procesos de degradación, hinchamiento o formación de poros (58).

3.2.3 Hinchamiento.

Efecto que se produce cuando las redes poliméricas absorben el solvente con el que están en contacto. Durante este proceso las cadenas de la red se desenrollan y estiran dependiendo de cuan favorable sea la interacción entre el polímero y el solvente. Como contraparte, aparece una fuerza retráctil que se opone al hinchamiento y actúa como una presión que ejercen las cadenas de la malla sobre el solvente. A medida que la red se hincha, esta presión elástica crece. En el estado de equilibrio, existe un balance de fuerzas atractivas y repulsivas (59).

Desde el punto de vista termodinámico, el cambio de volumen de una red polimérica depende de la energía libre total (DGtotal) (60). Cuando la DGtotal < 0 se favorece el hinchamiento del hidrogel. La DGtotal de hidrogeles neutros está compuesta por la energía libre de mezcla (DGmix) y la energía libre de elasticidad (DGel), tal como se muestra a continuación:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

El valor de la energía libre de mezcla (DGmix) crece durante procesos de hinchamiento y generalmente tiene signo negativo debido a la ganancia de entropía por la mezcla del solvente con el polímero. La energía libre de elasticidad (DGel) refleja la resistencia de la matriz con respecto al hinchamiento y tiene signo positivo porque la entropía disminuye cuando se estiran las cadenas del polímero. La energía libre de mezcla (DGmix) se puede descomponer en una contribución entálpica (DHmix) y en una entrópica (DSmix), tal como se indica en la ecuación 3.2.3.2:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

El cambio de entalpía (DHmix) se relaciona con el cambio de energía de la interacción entre las moléculas de polímero-solvente con respecto a las interacciones polímero-polímero y solvente-solvente. La entropía de mezcla (DSmix) es proporcional a la fracción molar de solvente en la red y se incrementa con el ingreso de solvente.

Reemplazando en la ecuación 3.2.3.2 la entalpía y entropía de mezcla de acuerdo a la teoría de Flory-Peppas (61) se obtiene la ecuación 3.2.3.3:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde Kb es la constante de Boltzman, T es la temperatura absoluta, f1s es la fracción de volumen de agua en el gel hinchado, f2s es la fracción de volumen de polímero en el gel hinchado, n1 es el número de moléculas de agua en el gel hinchado y c el parámetro de interacción polímero solvente.

La energía libre de elasticidad (DGel) tiene en cuenta la fuerza de retracción entrópica que restringe el hinchamiento. En la ecuación 3.2.3.4 se muestra la relación entre la energía libre y la entropía de elasticidad (DSel):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Reemplazando en la ecuación 3.2.3.4 la entropía de elasticidad de acuerdo a la teoría de Flory-Huggins (42) se obtiene:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde ve es el número efectivo de subcadenas de la red, a es el factor de expansión el cual se calcula (f2r/f2s)1/3 y f2r es la fracción de volumen del polímero en la red relajada.

El índice de hinchamiento IH se puede estimar teóricamente de acuerdo a la ecuación 3.2.3.6:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde f2r = V2/Vr, f2s= V2/Vs, V2 es el volumen de polímero seco, Vr es el volumen de la red en estado relajado y Vs es el volumen de la red hinchada.

El hinchamiento de hidrogeles iónicos depende además del grado de ionización de la red polimérica, el equilibrio de ionización entre el gel y el solvente, y el tipo de contraión presente en el medio. Los modelos que buscan explicar el hinchamiento de geles iónicos introducen el termino iónico (DGión) en la ecuación general 3.4.1 como se muestra en la ecuación 3.2.3.7:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

La contribución iónica puede ser explicada en base al equilibrio de Donnan en el cual el potencial químico de los iones, dentro y fuera del gel, es el mismo. El equilibrio de ionización determina que haya una capa de contraiones alrededor de los grupos fijos del hidrogel.

El índice de hinchamiento (IH) es una propiedad fisicoquímica de la matriz polimérica la cual se relaciona con el módulo elástico, con el peso molecular de las cadenas entre puntos de entrecruzamiento (Mc) y con el tamaño de poro (x) (en la figura 3.2.5 se muestra gráficamente el significado de Mc y x). Estas propiedades también influyen en el valor de la permeabilidad del polímero (P).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 3.2.5. Esquema de una red polimérica entrecruzada en donde se muestra el tamaño de poro ( x ) y el peso molecular entre puntos de entrecruzamiento (Mc).

Cuando se estudian las propiedades de los biosensores es importante evaluar la dependencia del hinchamiento con la temperatura. Algunos autores han demostrado que una enzima inmovilizada en un hidrogel pueden ser “switch on” (encendida) o “switch off” (apagada), hinchando o deshinchando respectivamente la estructura del polímero mediante modificaciones en la temperatura (62). Estos resultados pueden ayudar a interpretar el efecto de cambios en la temperatura en la actividad durante la conservación de sensores.

3.2.4 Coeficiente de distribución

(Dd): relación entre las concentraciones en equilibrio de una sustancia que está disuelta en dos fases inmiscibles y que están en contacto (63).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde Co y Cw son los valores de la concentración analítica del soluto en fase orgánica y en la fase acuosa, respectivamente. Este coeficiente depende particularmente del pH de la solución acuosa y de la relación de volúmenes entre la fase acuosa y orgánica.

3.3 Procesos de transporte en polímeros

La difusión es el proceso responsable del movimiento de la materia de una parte a otra a causa de su gradiente de concentración en ese sistema.

La velocidad de difusión es proporcional a la velocidad de los movimientos moleculares. En gases, los movimientos moleculares son rápidos mientras que en los líquidos mucho más lentos y más aún en los sólidos. La difusión depende de la temperatura, de la presión, del tamaño del soluto y de la viscosidad.

El primer tratamiento matemático de la difusión fue propuesto por Fick (64). La difusión de una especie a través de un área unitaria y en ausencia de otros movimientos como la migración y la convección puede describirse como:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde Jes el flujo por unidad de área, D es el coeficiente de difusión, C es la concentración, Zla distancia y ¶ CZ el gradiente de concentración en el eje Z.

La difusión en polímeros es un proceso complejo, las velocidades de difusión son intermedias entre sólidos y líquidos, y dependen fuertemente de la concentración y del grado de hinchamiento del polímero. La difusión del solvente está asociada a las propiedades físicas de la red del polímero y la interacción entre el polímero y el solvente.

La cantidad de solvente adsorbido por unidad de área de polímero al tiempo t es Mt de acuerdo a la ecuación 3.3.2:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Donde k es una constante, n es un parámetro relacionado al mecanismo de difusión y su valor está comprendido entre 0,5 y 1.

Alfrey (65) propuso una clasificación de acuerdo a la velocidad de difusión del solvente y a la velocidad de relajación del polímero:

- Difusión fickiana
- Difusión no fickiana
- Pura
- Anómala

- Difusión fickiana: se observa en polímeros cuando la temperatura está por encima de la temperatura de transición vítrea del polímero (tg). Cuando el polímero está en estado gomoso, las cadenas del polímero tienen alta movilidad lo cual permite una elevada penetración del solvente (66). Por lo tanto la difusión fickiana se caracteriza por una velocidad de difusión de solvente menor que la velocidad de relajación del polímero. Se observa un importante gradiente de penetración de solvente en estos sistemas. El perfil de concentración del solvente muestra un decrecimiento exponencial de la región completamente hinchada al centro del polímero. La distancia de difusión es proporcional a la raíz cuadrada del tiempo (n =0,5).

- Difusión no fickiana: se observa principalmente en polímeros vítreos cuando la temperatura está por debajo de tg, porque las cadenas del polímero no son lo suficientemente móviles para permitir la penetración inmediata del solvente al interior del polímero (66). La difusión puede ser no fikiana pura o anómala. La diferencia radica en la velocidad de difusión del solvente.

En la difusión tipo no fickiana pura, la velocidad de difusión es más rápida que la velocidad de relajación del polímero (n=1), en tanto que en la difusión anómala las velocidades de difusión y relajación son del mismo orden de magnitud (0,5> n >1).

En la mayoría de los casos, cuando la matriz del polímero pasa del estado relajado al estado hinchado de equilibrio con el solvente, los procesos de transporte que ocurren dentro de la misma son de tipo no fickianos. Por esta causa, cuando se prepara un biosensor, se debe dejar que la matriz alcance el equilibrio con el solvente. Cuando esto ocurre, los procesos de transporte de especies en bajas concentraciones se pueden considerar de tipo fickianos.

No existe una teoría general que describa el transporte de especies en todos los polímeros. Se han desarrollado modelos adecuados para casos particulares y hay artículos comparativos en bibliografía donde se muestra el avance realizado en el área (67).

Uno de los investigadores más destacados en el área es Peppas, el cual desarrolló una variedad de modelos que describen el transporte de solutos a través de polímeros en diferentes condiciones, basados en la teoría de volumen libre. La teoría de volumen libre supone que el transporte de especies ocurre a través del espacio no ocupado por las cadenas de polímeros. En estos modelos se tienen en cuenta muchos parámetros y es necesario tener vasta información sobre el sistema para describirlos adecuadamente.

El transporte a través de matrices poliméricas, en especial en matrices como la mucina es aún más complejo y depende de muchos factores, como la concentración del componente glicoproteico, el tamaño de las especies que difunden, la densidad de entrecruzamientos moleculares y el efecto barrera causado por interacciones físicas entre las cadenas macromoleculares. En general, en estos sistemas resulta más conveniente realizar determinaciones experimentales directamente sobre el analito en cuestión, por eso en esta tesis se realizan determinaciones de permeabilidad de solutos en matrices utilizando el método experimental desarrollado por Peppas para estudiar el transporte en geles y mucus (68).

3.4. Propiedades de los polímeros utilizados

3.4.1. Mucina: glicoproteína de alto peso molecular (2000 a 14000 KDa) capaz de formar geles viscoelásticos con un contenido acuoso que puede superar el 95%. Es el componente principal del mucus que lubrica y protege a las células epiteliales de agresiones de tipo mecánico, químico y de la degradación bacteriana. El mucus es una secreción viscosa, traslúcida que forma una capa continua, delgada y adherente en la superficie de la mucosa epitelial, cuyo espesor varía entre 50 a 450 mm en humanos (69).

La mucina tiene una unidad fundamental de peso molecular de 500 KDa que consiste en un esqueleto peptídico de alrededor de 500 aminoácidos ricos en serina, treonina y prolina (ver figura 3.4.1). En gran parte de su cadena peptídica se establecen uniones o-glucosídicas entre los restos hidroxílicos de los aminoácidos treonina y serina con cadenas oligosacáridas de entre 2 y 20 azúcares de tamaño (8 de promedio). Los azúcares que componen estos oligosacáridos son: galactosa, fucosa, N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y el ácido acetilneuramínico (acido siálico) (69, 70).

La fucosa y el acido siálico se alternan para formar el grupo terminal de las cadenas de azúcares. El conjunto de cadenas laterales constituye el 70-90% del peso de la glicoproteína porque hay una cadena de carbohidratos por cada cuatro aminoácidos en promedio. La región desnuda que no contiene cadenas laterales, comprende el 25% de la proteína y en ella se establecen numerosos puentes disulfuros, y en general esta zona es la más susceptible al ataque enzimático.

Debido a la densidad de ácido siálico (pKa 2,6) y los grupos sulfatos que llevan algunos azúcares, las moléculas de mucina se comportan como polielectrolito aniónico a pH neutro.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Figura 3.4.1. Izquierda: a y b) Esquemas propuestos para las estructura de la mucina. Derecha: Carbohidratos que componen las cadenas laterales de la mucina.

La mucina es una matriz que incorpora grandes cantidades de agua en su red y ha mostrado retener eficientemente la actividad de las enzimas con las cuales se ha ensayado. Además es totalmente biocompatible. La mucina se utilizó en sensores combinada con carbopol (25). Se obtuvieron excelentes resultados para un sensor de oxalato a pH ácido (2,8) (26). Es una matriz de difícil manipulación debido a que tiene consistencia gelatinosa laxa aún después del entrecruzamiento. Además es fácilmente degradable por microorganismos, lo que impide su conservación por largos períodos. La estabilidad de los sensores preparados con esta matriz es muy corta, sin embargo, se puede mejorar significativamente cuando se mezcla con carbopol (25).

3.4.2 Albúmina: es una de las proteínas más abundantes del sistema circulatorio de los mamíferos. Se sintetiza en el hígado y la concentración de referencia en sangre humana se encuentra entre 3,5 y 5,0 gdL-1. El resto de las proteínas plasmáticas se las denomina en conjunto globulinas. La fracción albúmina-globulina es aproximadamente del 55%. Cumple un rol fundamental en el transporte de ácidos grasos, metabolitos y drogas. Es muy importante para el mantenimiento de la presión oncótica, necesaria para la distribución correcta de líquidos corporales entre el compartimiento intravascular y extravascular. Al pH sanguíneo (7,35-7,45) la carga eléctrica predominante es negativa lo que evita su pérdida por filtración glomerular, debido a la carga negativa del glomérulo.

[...]


Final del extracto de 196 páginas

Detalles

Título
Estudio Químico y Electroquímico de Interacciones entre Biomoléculas y sus Aplicaciones en Biosensores
Subtítulo
Biosensores - Caracterización y Desarrollo
Universidad
Universidad Nacional de Córdoba  (Instituto de Investigaciones en Fisico-Química de Córdoba. INFIQC - CONICET)
Curso
Doctorado en Ciencias Químicas
Calificación
Sobresaliente
Autor
Año
2011
Páginas
196
No. de catálogo
V203505
ISBN (Ebook)
9783656327400
ISBN (Libro)
9783656327493
Tamaño de fichero
3340 KB
Idioma
Español
Etiqueta
Biosensores, electroquímica, lactato, química analítica
Citar trabajo
Marcelo Ricardo Romero (Autor), 2011, Estudio Químico y Electroquímico de Interacciones entre Biomoléculas y sus Aplicaciones en Biosensores, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/203505

Comentarios

  • No hay comentarios todavía.
Leer eBook
Título: Estudio Químico y Electroquímico de Interacciones entre Biomoléculas y sus Aplicaciones en Biosensores


Cargar textos

Sus trabajos académicos / tesis:

- Publicación como eBook y libro impreso
- Honorarios altos para las ventas
- Totalmente gratuito y con ISBN
- Le llevará solo 5 minutos
- Cada trabajo encuentra lectores

Así es como funciona