En esta tesis se establecen relaciones entre las respuestas de sensores amperométricos enzimáticos y las propiedades fisicoquímicas del sistema. Por consiguiente, no sólo analiza el efecto de aquellas variables experimentales que permitirían optimizar la respuesta analítica de un biosensor enzimático, sino también identificar funciones y variables que ayuden a comprender por qué ocurren ciertos cambios en la señal cuando se modifica la composición y construcción del biosensor.
Inicialmente, se conocía que la matriz influía en forma significativa y compleja sobre la respuesta del sensor, ya que afectaba directamente a la actividad de una dada biomolécula. A raíz de esto, se consideró que era indispensable diseñar experimentos que permitan discriminar la influencia de los procesos individuales para poder caracterizar e identificar a las variables que controlan al sistema. Una vez realizadas estas mediciones sería necesario establecer relaciones que ayuden a entender el efecto de cada variable sobre el funcionamiento global del sensor. Además de estas relaciones, se debería contar con modelos teóricos que puedan simular las respuestas experimentales. Esto permitiría comprender más fácilmente cómo los cambios en las propiedades fisicoquímicas del sistema afectan a parámetros analíticos como la sensibilidad, tiempo de respuesta y estabilidad del biosensor. Para lograr esto, se evalúa cómo cambian la viscoelasticidad, permeabilidad, conductividad y capacidad de hinchamiento de la matriz en función de los distintos componentes de la misma. Posteriormente, se relacionan mediante ecuaciones numéricas y/o analíticas con los cambios que resulten en los parámetros analíticos del biosensor.
Índice de contenidos
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Generalidades
1.2. Principio de operación
1.3. Ventajas y limitaciones
1.4. Antecedentes de sensores electroquímicos enzimáticos
1.5. Características e importancia del lactato
1.6. Objetivos
1.7. Hipótesis de trabajo
2. ENZIMAS
2.1. Actividad catalítica
2.2. Mecanismo de Michaelis Menten
2.3. Mecanismo de Ping-Pong para las enzimas rédox
2.4. Estabilidad
2.5. Enzimas inmovilizadas
2.6. Propiedades de las enzimas utilizadas
2.6.1. Lactato oxidasa
2.6.2. Glucosa oxidasa
3. SOPORTE DE LA ENZIMA
3.1. Clasificación y características generales
3.2. Propiedades de las matrices de hidrogel
3.2.1. Viscoelasticidad
3.2.2. Propiedades eléctricas
3.2.3. Hinchamiento
3.2.4. Coeficiente de distribución
3.3. Procesos de transporte en polímeros
3.4. Propiedades de los polímeros utilizados
3.4.1. Mucina
3.4.2. Albúmina
3.4.3. Carbopol
3.4.4. Quitosan
3.4.5. Mezclas de polímeros
3.5. Entrecruzamiento de la matriz
3.6. La membrana porosa
3.7. Membranas permeoselectivas
4. DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS
4.1. Mediciones de reología
4.2. Estudios de impedancia electroquímica
4.3. Análisis del índice de hinchamiento
4.4. Determinación del coeficiente de distribución
4.5. Mediciones del coeficiente de difusión
4.6. Estudios de ángulo de contacto
5. CRONOAMPEROMETRÍA Y TÉCNICAS DE CÁLCULO
5.1. Introducción
5.2. Cronoamperometría
5.3. Respuesta electroquímica de biosensores
5.4. Desarrollo de ecuaciones numéricas para simular la respuesta del biosensor
6. MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES
6.1. Preparación de soluciones y materiales
6.2. Potenciostato, celda y electrodos del biosensor
6.3. Matriz enzimática y construcción del biosensor
6.4. Determinaciones realizadas por cronoamperometría
6.5. Estudio de propiedades fisicoquímicas
7. DESARROLLO DEL SENSOR PARA LA DETERMINACION DE LACTATO
7.1. Introducción
7.2. Efectos de las variables experimentales sobre la sensibilidad
7.2.1. Efecto del pH
7.2.2. Efecto de la fuerza iónica
7.2.3. Efecto de la composición de la matriz
7.2.4. Efecto de la concentración del agente entrecruzante
7.2.5. Comparación del efecto del agente entrecruzante sobre los sensores de glucosa y lactato.
7.3. Estudios de propiedades analíticas
7.4. Conclusiones parciales
8. ANÁLISIS DE INTERFERENTES Y ESTUDIOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS
8.1. Caracterización de la membrana de nafion
8.2. Optimización de la respuesta a peróxido de hidrógeno
8.3. Bloqueo de la respuesta a ácido ascórbico
8.4. Aplicación de la membrana de nafion al biosensor de lactato
8.5. Efecto del nafion en la estabilidad del sensor
8.6. Ensayo de recuperación
8.7. Conclusiones parciales
9. EVALUACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DE LAS MATRICES POLIMERICAS
9.1. Índice de hinchamiento
9.1.1. Efecto de la composición
9.1.2. Efecto de la temperatura
9.2. Propiedades mecánicas – reología
9.3. Coeficiente de distribución
9.4. Permeabilidad
9.5. Espectroscopia de impedancia
9.6. Comparación de propiedades fisicoquímicas
10. MODELADO DEL BIOSENSOR DE LACTATO
10.1. Esquema general del biosensor de lactato
10.2. Diagrama y consideraciones del modelo numérico
10.3. Descripción de las ecuaciones del modelo numérico
10.4. Resultados de la simulación
10.5. Comparación de resultados experimentales con simulaciones
10.6. Introducción al modelado analítico del biosensor
10.7. Diagrama y consideraciones del modelo analítico
10.8. Descripción matemática del sistema
10.9. Análisis de la respuesta dinámica del sensor
10.9.1. Ecuación de la respuesta dinámica correspondiente a un único agregado de analito
10.9.2. Ecuación de la respuesta dinámica para múltiples agregados de analito
10.9.3. Ecuación límite a tiempo infinito
11. ANÁLISIS DE RESULTADOS EXPERIMENTALES CON EL MODELO
11.1. Determinación de la fracción oxidada
11.2. Efecto del espesor de membrana de policarbonato externa
11.3. Efecto del espesor de membrana de policarbonato interna
11.4. Efecto de la concentración de enzima
11.5. Efecto de la concentración de entrecruzante
12. COMPARACIÓN DE SENSORES DE GLUCOSA, LACTATO Y OXALATO UTILIZANDO EL MODELO ANALÍTICO
12.1. Introducción
12.2. Metodología y consideraciones
12.3. Comparación de la sensibilidad con la composición
12.4. Comparación de la respuesta dinámica
12.5. Correlación de propiedades fisicoquímicas y respuestas.
13. CONCLUSIONES GENERALES
Objetivos y temas de investigación
El presente trabajo doctoral tiene como objetivo principal el desarrollo y la caracterización de un biosensor electroquímico eficiente para la detección de lactato en muestras de sangre entera, estableciendo una correlación profunda entre las propiedades fisicoquímicas de las matrices empleadas en la inmovilización enzimática y la respuesta analítica del sensor.
- Estudio de la inmovilización de lactato oxidasa en matrices biocompatibles (mucina, albúmina, quitosan y carbopol).
- Optimización del proceso de entrecruzamiento enzimático mediante el uso de glutaraldehído.
- Desarrollo de modelos matemáticos y simulaciones para evaluar variables experimentales y predecir el comportamiento del biosensor.
- Análisis del efecto de interferentes biológicos y uso de membranas de nafion para mejorar la selectividad.
- Comparación comparativa del rendimiento de biosensores basados en diferentes analitos (lactato, glucosa, oxalato).
Auszug aus dem Buch
1.1. Generalidades
El biosensor es un dispositivo analítico que convierte un evento de reconocimiento biológico en una señal medible (1). Los biosensores están formados por tres componentes básicos, un elemento de biorreconocimiento, un transductor y un sistema de amplificación y procesamiento de la señal, figura 1.1.1 (1-4).
Cuando el elemento de biorreconocimiento entra en contacto con el analito se produce un cambio físico o químico que es detectado por el transductor a través de algún mecanismo y cuya respuesta es procesada y digitalizada para poder relacionarla de algún modo sencillo con la concentración del analito. Se han diseñado diferentes estrategias para inmovilizar al elemento de biorreconocimiento en (o cerca) de la superficie del transductor. Entre los más conocidos pueden citarse la unión covalente, la adsorción física, el atrapamiento y el entrecruzamiento (5). Este último combina a las estrategias de unión covalente y atrapamiento (5).
Tanto el elemento de biorreconocimiento como el mecanismo de transducción pueden variar de un biosensor a otro, lo que permite subdividirlos y clasificarlos de acuerdo a sus características específicas. Con respecto al elemento de biorreconocimiento los biosensores pueden clasificarse en: catalíticos o enzimáticos (2), de afinidad, los que a su vez se denominan inmunosensores si se emplean anticuerpos o haptenos (6), receptores de membrana y células (7), de hibridación (8), el cual involucra una etapa de reconocimiento en la que participan ácidos nucleicos y que es seguida por otra de amplificación usualmente enzimática, y elementos que involucran órganos, tejidos o incluso organismos enteros (9).
Resumen de los capítulos
1. INTRODUCCIÓN: Define el concepto de biosensor, su clasificación y la importancia clínica de la cuantificación de lactato.
2. ENZIMAS: Describe la actividad catalítica, los mecanismos de Michaelis-Menten y Ping-Pong, y las características específicas de las enzimas lactato oxidasa y glucosa oxidasa.
3. SOPORTE DE LA ENZIMA: Explora las propiedades físico-químicas de las matrices poliméricas (mucina, albúmina, carbopol, quitosán) y los métodos de entrecruzamiento.
4. DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS: Detalla las metodologías experimentales como reología, espectroscopia de impedancia y medición de ángulo de contacto.
5. CRONOAMPEROMETRÍA Y TÉCNICAS DE CÁLCULO: Analiza la teoría de la cronoamperometría y el uso de diferencias finitas para el modelado matemático.
6. MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES: Describe la preparación de reactivos y la construcción física del biosensor.
7. DESARROLLO DEL SENSOR PARA LA DETERMINACION DE LACTATO: Presenta los resultados experimentales sobre el efecto del pH, fuerza iónica y composición de la matriz en la sensibilidad del sensor.
8. ANÁLISIS DE INTERFERENTES Y ESTUDIOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS: Evalúa la aplicación de membranas de Nafion para reducir la interferencia de especies como el ascorbato en sangre.
9. EVALUACIÓN DE PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS DE LAS MATRICES POLIMERICAS: Correlaciona el índice de hinchamiento, la reología y la permeabilidad con la composición de las matrices.
10. MODELADO DEL BIOSENSOR DE LACTATO: Desarrolla un modelo numérico y analítico para predecir el comportamiento del sensor.
11. ANÁLISIS DE RESULTADOS EXPERIMENTALES CON EL MODELO: Compara los resultados experimentales con las predicciones del modelo desarrollado.
12. COMPARACIÓN DE SENSORES DE GLUCOSA, LACTATO Y OXALATO UTILIZANDO EL MODELO ANALÍTICO: Extiende el análisis del modelo a otros tipos de biosensores.
13. CONCLUSIONES GENERALES: Sintetiza los hallazgos principales del trabajo de investigación y su aplicabilidad.
Palabras clave
Biosensores, Lactato oxidasa, Matriz polimérica, Mucina, Albúmina, Cronoamperometría, Hidrogeles, Entrecruzamiento, Glutaraldehído, Nafion, Modelado matemático, Diferencias finitas, Espectroscopia de impedancia, Reología, Sangre entera.
Preguntas frecuentes
¿Cuál es el propósito fundamental de esta tesis doctoral?
La tesis busca desarrollar y caracterizar un biosensor electroquímico para la detección de lactato en muestras de sangre entera, utilizando matrices poliméricas optimizadas para mejorar la estabilidad y sensibilidad del dispositivo.
¿Qué matrices se evalúan para la inmovilización de las enzimas?
Se evalúan principalmente matrices compuestas por mucina y albúmina, así como el uso de quitosán y carbopol, analizando su comportamiento físico-químico mediante estudios reológicos y de hinchamiento.
¿Cuál es la función del glutaraldehído en el desarrollo del biosensor?
El glutaraldehído actúa como agente entrecruzante químico, permitiendo formar redes estables de hidrogel que retienen la enzima, evitando su difusión hacia la solución externa.
¿Qué metodología matemática se emplea para modelar el biosensor?
Se utiliza un método de simulación digital basado en la resolución de la segunda ley de Fick mediante diferencias finitas, lo que permite predecir el comportamiento dinámico del sensor.
¿Cómo se abordan los problemas de interferencia en muestras biológicas?
Se implementa una membrana permeoselectiva de Nafion, la cual posee carga negativa y limita el acceso de especies aniónicas interferentes, como el ascorbato, a la superficie del electrodo.
¿Cuáles son los principales indicadores analíticos obtenidos?
La investigación determina la sensibilidad analítica, el límite de detección (LD), el intervalo lineal, el tiempo de respuesta y la estabilidad de almacenamiento a largo plazo.
¿Por qué la combinación mucina/albúmina 70/30 es considerada óptima?
Porque proporciona el equilibrio adecuado entre hidratación, estabilidad mecánica y retención de la actividad enzimática, superando las limitaciones individuales de cada proteína.
¿Qué importancia tiene el estudio del coeficiente de distribución en la matriz?
Es vital para comprender cómo se particiona el analito entre la matriz y el medio, permitiendo ajustar los modelos de transporte de masa dentro del hidrogel.
¿Cómo afecta la temperatura al índice de hinchamiento de estas matrices?
La temperatura influye en la entropía y elasticidad de la red; el estudio de ciclos térmicos ayuda a evaluar la reversibilidad del hinchamiento y la estabilidad del sistema ante variaciones ambientales.
- Citar trabajo
- Marcelo Ricardo Romero (Autor), 2011, Estudio Químico y Electroquímico de Interacciones entre Biomoléculas y sus Aplicaciones en Biosensores, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/203505
