Zwischen diesen Aussagen liegen ungefähr 30 Jahre, in denen die Resistenz von Bakterien gegenüber Antibiotika stark zugenommen hat. Immer noch sind akute Atemwegsinfektionen, insbesondere Pneumonien, die Haupttodesursache weltweit (HEYMANN, 2000). Seit der Entdeckung des Penicillins durch Sir Alexander Fleming 1928 war vor allem in den 1940er Jahren eine rasante Entwicklung neuer Antibiotika zu verzeichnen (AMYES, 2000). Darunter Streptomycin (1944), Chloramphenicol (1947), Chlortetracyclin (1948) und Erythromycin (1952). Heutzutage gibt es etwa sieben große Antibiotikaklassen, die an drei verschiedenen Angriffspunkten wirken (MUTSCHLER, 1996). Dies sind
> Hemmung der Zellwandsynthese, durch die Gruppen der Penicilline und Cephalosporine
> Blockade der Proteinbiosynthese, verursacht durch Aminoglykoside, Tetracycline und Makrolide
> Unterdrückung der Nukleinsäuresynthese, bewirkt durch Sulfonamide und (Fluor) Chinolone
Zeitgleich mit der Entdeckung bzw. Weiterentwicklung von Wirkstoffen, entstanden Resistenzen gegen Antibiotika. Mutationen oder Gentransfer führten zu Bakterien, die nicht mehr mit den ursprünglich wirksamen Stoffen bekämpft werden konnten. Häufig weisen diese Erreger eine Multiresistenz gegenüber verschiedenster Antibiotika auf. Als besonders gefährlich gelten heute beispielsweise Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) und Vancomycinresistente Enterokokken (VRE). Abbildung 1 zeigt den Anstieg von MRSA in britischen Krankenhäusern in den Jahren 1987 bis 1997. Generell hat die Häufigkeit von Resistenzen gegenüber Antibiotika bei fast allen wichtigen bakteriellen Infektionserregern weltweit zugenommen (BAQUERO, 1996). Auch in Deutschland ist ein Anstieg zu verzeichnen. So ist z.B. zwischen 1998 und 2001 eine Resistenzzunahme von E. coli gegenüber Ciprofloxacin (Fluorchinolon) von 7,7 auf 14,5 % ermittelt worden. Die Resistenzraten von E. coli gegenüber Ampicillin stiegen von 40 auf 50 % (PEG, 2001).
Eine der Hauptursachen für die Entstehung von Resistenzen ist der falsche Umgang mit Antibiotika. Darunter fallen unnötige oder falsche Verschreibungen, falsche Anwendung und unkontrollierte Erwerbsmöglichkeiten. Auch der intensive Gebrauch von Antibiotika in Krankenhäusern fördert die Resistenzentwicklung (WHO, 2000).
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Die ß-Laktam-Antibiotika
1.1.1. Penicilline (Pename)
1.1.2. Cephalosporine (Cepheme)
1.1.3. Carbapeneme
1.1.4. Monobaktame
1.1.5. ß-Laktamase-Inhibitoren
1.2. Wirkungsweise von ß-Laktam-Antibiotika
1.2.1. Der Aufbau der bakteriellen Zellwand
1.2.2. Die Angriffspunkte der ß-Laktam-Antibiotika
1.3. ß-Laktamasen
1.3.1. ß-Laktamasen der Gruppe 1
1.3.1.1. Chromosomale, nicht induzierbare AmpC-ß-Laktamasen
1.3.1.2. Chromosomale, induzierbare AmpC-ß-Laktamasen
1.3.1.3. Plasmid-kodierte AmpC-ß-Laktamasen
1.3.2. ß-Laktamasen der Gruppe 2
1.3.3. ß-Laktamasen der Gruppen 3 und 4
1.4. Regulation der ß-Laktamase-Expression
1.4.1. Die ß-Laktamase-Expression bei C. freundii und E. cloacae
1.4.2. Das AmpR-Protein
1.5. Zielsetzung der Arbeit
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Bakterienstämme
2.1.2. Enzyme
2.1.3. Plasmide
2.1.4. Oligonukleotide
2.1.5. DNA- und Protein-Marker
2.1.6. Chemikalien
2.1.7. Nährmedien und Antibiotika
2.1.8. Häufig verwendete Puffer und Lösungen
2.1.9. Geräte und Verbrauchsmaterialien
2.1.10. Computer-Software
2.2. Methoden
2.2.1. Mikrobiologische Methoden
2.2.1.1. Anzucht von Bakterien
2.2.1.2. Herstellung CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen
2.2.1.3. Calciumchlorid-Transformation von E. coli-Zellen
2.2.2. Molekulargenetische Arbeiten
2.2.2.1. Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli
2.2.2.1.1. Plasmid-Schnellpräparation (GOODE UND FEINSTEIN, 1992)
2.2.2.2. Agarose-Gelelektrophorese
2.2.2.3. Rückgewinnung von DNA aus Agarosegelen
2.2.2.4. Restriktion und Modifikation von DNA
2.2.2.5. Sequenzanalyse von DNA
2.2.2.6. Amplifikation von DNA mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
2.2.3. Proteinchemische Methoden
2.2.3.1. Expression des AmpR-Proteins als Fusionsprotein
2.2.3.2. Expression des AmpR-Proteins ohne Fusionsanteile
2.2.3.3. Quantitative Proteinbestimmung nach BRADFORD (1976)
2.2.3.4. Quantitative Proteinbestimmung mittels BCA-Assay
2.2.3.5. Quantitative Proteinbestimmung mittels UV-Photometrie
2.2.3.6. Analyse von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.2.3.7. Transfer von Proteinen auf Membrane („Western Blotting“)
2.2.3.8. Isolierung von Inclusion Bodies
2.2.3.9. Aufreinigung des AmpR Proteins
2.2.3.9.1. DNA-Affinitätschromatographie
2.2.3.9.2. Heparin-Affinitätschromatographie
2.2.3.9.3. Größenausschlußchromatographie (Gelfiltration)
2.2.3.10. Aufreinigung des NusA-AmpR Fusionsproteins
2.2.3.10.1. Metallchelat-Affinitätschromatographie
2.2.3.10.2. Größenausschlusschromatographie (Gelfiltration)
2.2.3.10.3. Thrombin-Spaltung von gereinigtem NusA/AmpR-Protein
2.2.3.10.4. Separation von NusA und AmpR-Protein
2.2.3.11. Aktivitätstest von gereinigtem AmpR-Protein mittels Bandshift-Assay (EMSA)
2.2.3.12. Silberfärbung von Polyacrylamid-Gelen nach NESTERENKO et al.
2.2.4. Isolierung von Muropeptiden
2.2.4.1. Präparation eines „Hot water Extraktes“ (verändert nach JACOBS et al., 1994)
2.2.4.2. Auftrennung von löslichen Zellbestandteilen mittels HPLC
2.2.4.3. Entsalzung von Muropeptiden mittels HPLC
2.2.4.4. Massenspektrometrische Analyse der isolierten Muropeptide
2.2.4.5. Analyse von 3H-markierten Muropeptiden im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer
2.2.5. Untersuchungen zur ß-Laktamase-Expression
2.2.5.1. Expressionsstudien mittels RT-PCR
2.2.5.1.1. Synthese von mRNA durch In-vitro Transkription
2.2.5.1.2. Amplifikation von mRNA mittels RT-PCR
2.2.5.2. Expressionsstudien mittels Real-Time RT-PCR
2.2.5.3. Durchführung von In-vivo Expressionsstudien
2.2.6. Kristallisation von AmpR
3. Ergebnisse
3.1. Expression und Reinigung verschiedener Varianten des AmpR-Proteins
3.1.1. Expression und Reinigung des AmpR-Proteins aus C. freundii
3.1.2. Expression und Reinigung eines NusA/AmpR-Fusionsproteins
3.2. Isolation von Muropeptiden mittels HPLC
3.2.1. Isolation des (1,6-anhydro)-MurNac-Tripeptids
3.2.2. Isolation des (1,6-anhydro)-MurNac-Pentapeptids
3.3. Expressionsanalysen der AmpC-ß-Laktamase
3.3.1. Detektion mittels RT-PCR
3.3.2. Detektion mittels Real-Time RT-PCR
3.4. Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des AmpR-Proteins
4. Diskussion
4.1. Expressionsanalysen des ampC-ß-Laktamase-Gens
4.2. Aufklärung der Kristallstruktur des AmpR-Proteins
5. Zusammenfassung
6. Literaturverzeichnis
7. Anhang
7.1. Abbildungsverzeichnis
7.2. Tabellenverzeichnis
7.3. Abkürzungsverzeichnis
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit befasst sich mit der Aufklärung des Induktionsmechanismus von chromosomalen AmpC-ß-Laktamasen bei den Enterobakterien Enterobacter cloacae und Citrobacter freundii. Das Ziel besteht darin, durch eine detaillierte Untersuchung der Interaktion zwischen dem regulatorischen Protein AmpR und spezifischen Signalmolekülen (Muropeptiden) zu klären, wie die Expression der ß-Laktamase gesteuert wird, um langfristig Ansatzpunkte für neue therapeutische Strategien gegen antibiotikaresistente Keime zu finden.
- Aufklärung der Rolle von AmpR als Transkriptionsfaktor in der Regulation der ß-Laktamase-Expression.
- Isolierung und Reinigung von AmpR-Protein sowie dessen strukturelle Untersuchung mittels Röntgenkristallographie.
- Vergleichende Analyse der induzierenden Wirkung von (1,6-anhydro)-MurNac-Tripeptid und (1,6-anhydro)-MurNac-Pentapeptid.
- Optimierung von Isolations- und Reinigungsmethoden für Muropeptide aus E. coli mittels HPLC.
- Etablierung und Evaluierung eines Transkriptions-Assays zur quantitativen Erfassung der Genexpression unter Einfluss verschiedener Liganden.
Auszug aus dem Buch
1.4.2. Das AmpR-Protein
Für die Induzierbarkeit der ß-Laktamase-Expression ist das AmpR-Protein unbedingt erforderlich (LINDBERG et al., 1985). In Spezies wie E. coli, deren Laktamase nicht induzierbar ist, wurde das ampR-Gen vermutlich deletiert (HONORE et al., 1986).
AmpR ist 32 kDa groß und gehört zur Familie der LysR-Transkriptionsfaktoren (LINDQUIST et al., 1989). Diese Proteinfamilie wurde nach dem Transkriptionsfaktor der lysA-Gens (Lysin-Synthetase) aus E. coli benannt (STRAGIER et al., 1983). Mittlerweile sind über 50 Proteine bekannt, die in diese Gruppe gehören (HENIKOFF et al., 1988; SCHELL, 1993). Alle LysR Transkriptionsfaktoren besitzen am N-terminalen Ende ein Helix-Turn-Helix-Motiv, das sie befähigt an DNA zu binden. Die Transkriptionsfaktoren werden selbst durch niedermolekulare Liganden reguliert (SCHELL, 1993).
Die Regulation der ß-Laktamase-Expression durch AmpR ist in den Enterobakterien weit verbreitet. So wurde außer bei C. freundii und E. cloacae das ampR-Gen auch bei M. morganii und Y. enterocolitica gefunden (POIREL et al., 1999; SEOANE et al., 1992). Auch außerhalb der Enterobacteriaceae wurde ein ähnliches Protein entdeckt. Bei P. aeruginosa ist die chromosomale AmpC-ß-Laktamase ebenfalls durch AmpR reguliert (LODGE et al., 1993).
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Erläutert die Grundlagen der Antibiotikaresistenz, die Rolle der ß-Laktamasen sowie den Regulationsmechanismus der Expression von AmpC-ß-Laktamasen bei Enterobakterien.
2. Material und Methoden: Beschreibt die verwendeten Stämme, Plasmide, Puffer, chemischen Reagenzien sowie die biochemischen und molekulargenetischen Arbeitstechniken zur Proteinreinigung, Muropeptid-Isolierung und Expressionsanalyse.
3. Ergebnisse: Dokumentiert die erfolgreiche Überexpression und Reinigung von AmpR und NusA/AmpR-Proteinen, die Isolierung der Muropeptide sowie die Versuche zur Quantifizierung der Genexpression.
4. Diskussion: Interpretiert die Ergebnisse bezüglich der Schwierigkeiten bei der Regulation des AmpR-Proteins, der Spezifität der Liganden-Aufnahme und bewertet die Eignung der eingesetzten Methoden für die Zielsetzung.
5. Zusammenfassung: Fasst die wesentlichen Erkenntnisse zur Bedeutung der AmpC-ß-Laktamase, der Herausforderungen bei der Proteinreinigung und der experimentellen Untersuchungen zusammen.
6. Literaturverzeichnis: Listet die für die Dissertation verwendeten wissenschaftlichen Fachquellen auf.
7. Anhang: Enthält detaillierte Verzeichnisse der Abbildungen, Tabellen und Abkürzungen.
Schlüsselwörter
AmpR-Protein, ß-Laktamase, Antibiotikaresistenz, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Induktion, Muropeptide, Peptidoglykan, Genregulation, Proteinreinigung, Real-Time RT-PCR, HPLC, Transkriptionsfaktor, LysR-Familie, Zellwand.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit grundlegend?
Die Arbeit untersucht die molekularen Mechanismen der Resistenzentwicklung gegenüber ß-Laktam-Antibiotika, speziell die Regulation der AmpC-ß-Laktamase bei gramnegativen Bakterien wie Enterobacter cloacae und Citrobacter freundii.
Welche zentralen Themenfelder stehen im Fokus?
Der Fokus liegt auf der Rolle des Transkriptionsfaktors AmpR, der Interaktion mit Murein-Abbauprodukten (Muropeptiden) und den technischen Herausforderungen bei der Expression und Reinigung dieser Proteine.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Ziel war es, den Induktionsmechanismus besser zu verstehen, indem die Effekte spezifischer Liganden (aM-Tripeptid und aM-Pentapeptid) auf die Genexpression verglichen und die dreidimensionale Struktur von AmpR analysiert werden sollten.
Welche wissenschaftlichen Methoden wurden eingesetzt?
Es wurden mikrobiologische Anzuchtsmethoden, molekulargenetische Techniken (PCR, RT-PCR, Real-Time RT-PCR), proteinchemische Methoden (SDS-PAGE, Western Blot, Affinitätschromatographie) sowie analytische HPLC zur Isolierung von Muropeptiden verwendet.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine detaillierte Darstellung der Materialien und Methoden, die experimentellen Ergebnisse zur Proteinreinigung und Expressionsanalyse sowie eine kritische Diskussion der Daten im Vergleich mit der bestehenden Literatur.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Die Arbeit wird wesentlich durch Begriffe wie AmpR, ß-Laktamase, Muropeptide, Genregulation, induzierbare Resistenz und bakterielle Zellwandsynthese definiert.
Warum konnte die Induktion in den Experimenten teils nicht repliziert werden?
Es wird diskutiert, dass das Plasmid pNU305 über die Zeit inaktiv geworden sein könnte oder dass die Permeabilität der äußeren Bakterienmembran für die verwendeten Liganden die limitierende Schwelle für die Induktionsversuche in lebenden Zellen darstellte.
Welche Rolle spielt das NusA-Protein in dieser Arbeit?
Das NusA-Protein wurde als Fusionspartner verwendet, um das Löslichkeitspotential des ansonsten zur Aggregation neigenden AmpR-Proteins zu erhöhen und somit dessen native Reinigung zu ermöglichen.
- Quote paper
- Christine Schneider (Author), 2004, Neue Strukturen und Targets für beta-Laktamase-Inhibitoren, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/32337
