Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nichttranslatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E)

Bachelor Thesis , 2015 , 72 Pages , Grade: 14

Biology - Virology

Der 5′-UTR-Bereich des Coronavirus-229E-Genoms enthält einige konservierte RNA-Strukturelemente, die vermutlich als cis-aktive Elemente für die virale RNA-Synthese benötigt werden. Einige dieser Elemente sind möglicherweise auch an sogenannten long-range-Interaktionen mit dem 3′-terminalen Ende des Genoms beteiligt.

In dieser Bachelorarbeit wurde ein revers-genetischer Ansatz verwendet, um die Bedeutung der Stammschleifen (SL)-Strukturen 4 und 5 näher zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden Mutanten des humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E) erzeugt, die spezifische Nukleotidsubstitutionen in den SL4- bzw. SL-5-Strukturen enthielten, die (laut computergestützten Strukturvorhersagen) zu einer Destabilisierung der entsprechenden Strukturelemente führen sollten. Mögliche Auswirkungen der Mutationen auf die HCoV-229E-Replikation in Zellkultur wurden durch Bestimmung der Virustiter nach der Transfektion von In-vitro-transkribierter HCoV-229E-Genom-RNA (Wildtyp bzw. mutiert) untersucht. Außerdem wurde durch Sequenzanalysen von Teilbereichen der Genome der erhaltenen Viren untersucht, ob die eingeführten Mutationen stabil waren oder aber Reversionen oder kompensatorische Mutationen im 5′-UTR-Bereich auftraten. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass eine Destabilisierung des basalen Anteils der SL4-Struktur (Stamm 4a) relativ gut toleriert wird. In allen Fällen wurden lebensfähige Mutanten isoliert, wenngleich die Virustiter geringfügig reduziert waren und erste Hinweise für kompensatorische Mutationen bei einzelnen Virusmutanten erhalten wurden.

Zur Vorbereitung weiterer Studien wurden in einem zweiten Teil der Arbeit erste Schritte unternommen zur Herstellung von HCoV-229E-SL5-Mutanten, die spezifische Nukleotidsubstitutionen in den Schleifenregionen der SL5a/b/c-Strukturen enthalten.

Inhaltsverzeichnis (Table of Contents)

• Abbildungen
• Abkürzungen
• Zusammenfassung
• Abstract
• 1 Einleitung
  • 1.1 Einführung
  • 1.2 Klassifikation der Nidovirales
  • 1.3 Morphologie der Coronavirinae
  • 1.4 Genomorganisation und Replikation von Coronaviren
    • 1.4.1 Genomstruktur
    • 1.4.2 Replikation und Transkription
    • 1.4.3 Sekundärstrukturen im UTR-Bereich
      • 1.4.3.1 SL-Struktur 1 (SL1)
      • 1.4.3.2 SL-Struktur 2 (SL2)
      • 1.4.3.3 SL-Struktur 3 (SL3)
      • 1.4.3.4 SL-Struktur 4 (SL4)
      • 1.4.3.5 SL-Struktur 5 (SL5)
  • 1.5 Zielsetzung
  • 2 Material und Methoden:
    • 2.1 Medien und Lösungen
      • 2.1.1 Zellkulturmedium
      • 2.1.2 TAE-Puffer (50x)
      • 2.1.3 LB-Medium
        • 2.1.3.1 LB-Medium + Agar
        • 2.1.3.2 LB-Medium + Ampicillin
        • 2.1.3.3 LB-Medium + Ampicillin + Agar
      • 2.1.4 TE-Puffer
        • 2.1.4.1 TE-Puffer + Saccharose
      • 2.1.5 DNase-Puffer (10x)
      • 2.1.6 Proteinase-K-Puffer (2x)
      • 2.1.7 Minipräparation
    • 2.2 Zellkultur
      • 2.2.1 Zellen splitten
      • 2.2.2 Zellen zählen
      • 2.2.3.Verwendete Zelllinien
    • 2.3 Virus
      • 2.3.1 HCOV-229E
        • 2.3.1.1 Transfektion
        • 2.3.1.2 TCID 50
        • 2.3.1.3 Plaque-Test
        • 2.3.1.4 Passagieren von HCOV-229E
      • 2.3.2 Arbeiten mit Vacciniaviren
        • 2.3.2.1 Virussufreinigung
        • 2.3.2.2 DNA-Tranfektion von Vaccinia-infizierten Zellen
        • 2.3.2.3 gpt-Negativselektion
    • 2.4 RNA
      • 2.4.1 RNA-Isolation
      • 2.4.2 Quantifizierung der RNA-Konzentration
      • 2.4.3 Reverse Transkription
      • 2.4.4 In-vitro-Transkription
      • 2.4.5 Auftrennung von RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese
    • 2.5 DNA
      • 2.5.1 PCR
      • 2.5.2 Auftrennung von DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese
      • 2.5.3 Restriktionsverdau
        • 2.5.3.1 Dpnl-Verdau
        • 2.5.3.2 Clal-Verdau
      • 2.5.4 DNA-Sequenzierung
      • 2.5.5 Plasmid-DNA-präparation (Minipräparation)
      • 2.5.6 DNA-Fällung
      • 2.5.7 Bestimmung der DNA-Konzentration
    • 2.6 Bakterien
      • 2.6.1 Transformation
    • 2.7 Verwendete Kits
    • Ergebnisse
    • 3.1 Stammschleife 5 (SL5) von HCOV-229E
      • 3.1.1 Theoretischer Hintergrund
        • 3.1.1.1 Deletionsmutanten
        • 3.1.1.2 Single Nukleotidmutanten
        • 3.1.1.3 Mehrfachmutante
      • 3.1.2 Mutagenese
      • 3.1.3 Negativselektion
    • 3.2 SL4
      • 3.2.1 Theoretischer Hintergrund
        • 3.2.1.1 Minimal\"-mutanten
        • 3.2.1.2,,Maximal\"-mutanten
      • 3.2.2 in-vitro-Transkription der Volllängen-HCOV-229E-Genom-RNA
      • 3.2.3 Transfektion
      • 3.2.4 TCID 50-Bestimmung (Passage 0)
      • 3.2.5 Sequenz-Analyse von SL4-Mutanten
        • 3.2.5.1 Passage 0 #1
        • 3.2.5.2 Passage 0 #2
      • 3.2.6 Plaque-Test
      • 3.2.7 Passagen 1-5
        • 3.2.7.1 TCID 50 Passage 1
      • 3.2.8 Passage 6
        • 3.2.8.1 Passage 6 #1
        • 3.2.8.2 Passage 6 #2
    • 4 Diskussion
    • 5 Ausblick
    • 6 Referenzen

    Zielsetzung und Themenschwerpunkte (Objectives and Key Themes)

    Diese Bachelorarbeit befasst sich mit der Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nicht translatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCOV-229E). Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle dieser RNA-Elemente bei der Replikation und Transkription des Virus zu untersuchen. Hierzu wurden verschiedene Mutanten des HCOV-229E-Genoms erstellt und deren Auswirkungen auf die Virusreplikation und -transkription in Zellkultur untersucht.

    • Die Rolle von cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-UTR des HCOV-229E-Genoms
    • Die Auswirkungen von Mutationen in diesen RNA-Elementen auf die Virusreplikation und -transkription
    • Die Identifizierung von Schlüsselstrukturen und -funktionen dieser RNA-Elemente
    • Die Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung von Coronavirus-Infektionen

    Zusammenfassung der Kapitel (Chapter Summaries)

    Das erste Kapitel bietet eine Einführung in die Welt der Coronaviren und deren Klassifikation, Morphologie und Genomorganisation. Es beleuchtet auch die Replikation und Transkription des Virus sowie die Sekundärstrukturen im UTR-Bereich. Das zweite Kapitel beschreibt die Materialien und Methoden, die in dieser Arbeit verwendet wurden. Dies umfasst Zellkulturtechniken, Virusmanipulationen, RNA- und DNA-Techniken sowie bakterielle Transformationen. Das dritte Kapitel präsentiert die Ergebnisse der Untersuchungen zu den Stammschleifen 5 (SL5) und 4 (SL4) des HCOV-229E-Genoms. Es werden die generierten Mutanten, die negativen Selektionsergebnisse sowie die Auswirkungen der Mutationen auf die Virusreplikation und -transkription beschrieben.

    Schlüsselwörter (Keywords)

    Humanes Coronavirus 229E (HCOV-229E), cis-aktive RNA-Elemente, 5'-UTR, Stammschleife, Replikation, Transkription, Mutanten, Negativselektion, Plaque-Test, TCID50.

• College: Justus-Liebig-University Giessen (Medizinische Virologie)
• Grade: 14
• Author: Marvin Strauch (Author)
• Publication Year: 2015
• Pages: 72
• Catalog Number: V354215
• ISBN (eBook): 9783668403765
• ISBN (Book): 9783668403772
• Language: German
• Tags: charakterisierung, rna-elementen, region, rna-genoms, humanen, coronavirus, hcov-229e