Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten


Diplomarbeit, 2010
97 Seiten, Note: 1,0

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG
1.1 Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum
1.2 Blutstadien-Antigene und ihre Bedeutung für die Vakzinentwicklung
1.3 Merozoit-Oberflächen-Protein 1
1.4 MSP119 als Impfstoffkandidat
1.5 Die MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
1.6 DsRed - Das rot-fluoreszierende Protein
1.7 Pflanzen als Expressionssysteme
1.8 Zielsetzung

2 MATERIAL
2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
2.2 Enzyme, Antikörper und Reaktionkits
2.3 Medien, Lösungen und Puffer
2.4 Geräte, Apparaturen und Zubehör
2.5 Vektoren
2.6 Synthetische Gene
2.7 Synthetische Oligonukleotide (Primer)
2.8 Bakterienstämme und Pflanzen

3 METHODEN
3.1 Molekularbiolgische Methoden
3.1.1 Anzucht von E. coli und Herstellung von Stammkulturen
3.1.2 Hitzeschocktransformation von E.coli
3.1.3 Kultivierung von A. tumefaciens und Herstellung von Stammkulturen
3.1.4 Elektroporation von A. tumefaciens
3.1.5 Plasmidisolation aus E. coli (Minipräparation)
3.1.6 Restriktion von DNA
3.1.7 Analytische und präparative Agarosegelelektrophorese
3.1.7.1 Analytische Agarosegelelektrophorese
3.1.7.2 Präparative Agarosegelelektrophorese
3.1.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
3.1.9 Ligation
3.1.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.1.11 Kolonie-PCR rekombinanter Bakterien
3.1.12 Enzymatische DNA-Sequenzierung nach Sanger
3.2 Proteinchemische und immunologische Methoden
3.2.1 Extraktion löslicher Proteine aus Pflanzenmaterial
3.2.2 Hitzefällung des Pflanzenextraktes
3.2.3 Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
3.2.4 Diskontinuierliche SDS-PAGE
3.2.5 Sensitive Coomasssie Blue R-250 Färbung
3.2.6 Western Blot
3.2.7 Korrelative Proteinquantifizierung mittels Fluoreszenzmessung
3.2.8 Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Biacore)
3.2.9 Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
3.3 Pflanzen
3.3.1 Kultivierung von N. tabacum und N. benthamiana im Gewächshaus
3.3.2 Transiente Expression in N. tabacum und N. benthamiana
3.4 Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed

4 ERGEBNISSE
4.1 Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten
4.1.1 Konstruktion der MSP119-Expressionsvektoren
4.1.2 Temperaturstabilität von HEK- und Tabak-produziertem MSP119
4.1.3 Transiente Expression der MSP119-Proteinvarianten in N. tabacum
4.1.4 Reinigung MSP119-Proteinvarianten
4.1.5 Charakterisierung der Fusionsproteine auf dem Biacore T100-System
4.1.6 Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
4.2 Klonierung und Produktion chimärer Varianten der MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
4.2.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für die schwere und leichte Kette der chimären mABs 12.8 und 12.10
4.2.2 Transiente Expression der chimären Antikörper
4.2.3 Reinigung der chimären mAbs 12.8 und 12.10
4.2.4 Charakterisierung der gereinigten chimären Antikörper mAb 12.8 und 12.10 auf dem Biacore T100-System

5 DISKUSSION UND AUSBLICK
5.1 Charakterisierung der MSP119-Proteinvarianten
5.2 Charakterisierung der chimären mAbs 12.8 und 12.10

6 ZUSAMMENFASSUNG

7 LITERATURVERZEICHNIS

8 ANHANG
8.1 Abkürzungsverzeichnis
8.2 Abbildungsverzeichnis
8.3 Tabellenverzeichnis
8.4 Vakuuminfiltration von N. benthamiana -Pflanzen
8.5 Apparaturaufbau der IMAC
8.6 Gereinigte MSP119-DsRed-Fusionproteine
8.7 ELISA-Analyse des Immunisierungsversuchs

Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. Rainer Fischer für die Gelegenheit diese Diplomarbeit am Fraunho- fer-Institut für Molekularbiologie und Angewandte Oekologie (IME) anfertigen zu können.

Herrn Dr. Nikolaus Schlaich bin ich für die freundliche Übernahme des Koreferats und dem Interesse an meiner Arbeit sehr dankbar.

Herrn Dr. Stefan Schillberg möchte ich dafür danken meine Diplomarbeit in der Abteilung „Plant Biotechnology“ ausarbeiten zu können.

Ganz besonders möchte ich mich bei Alexander Boes, Markus Sack, Holger Spiegel und Thomas Rademacher für ihre sehr gute fachliche Betreuung und Unterstützung, sowie ihre ständige Diskussionsbereitschaft und Geduld bedanken.

Für das freundliche und angenehme Arbeitsklima, sowie die herzliche Aufnahme in ihre Ar- beitsgruppe, möchte ich der gesamten „Plant Biotechnology“-Abteilung meinen Dank aus- sprechen.

Abschließend möchte ich meiner Familie herzlichst für ihre moralische und finanzielle Unterstützung während meines Studiums und dieser Diplomarbeit danken.

1 Einleitung

Die ausgedehnte globale Verteilung, die Anzahl und das Ausmaß der Infektionen so- wie die gravierenden wirtschaftlichen Auswirkungen auf die betroffenen Bevölkerungsgrup- pen, machen Malaria selbst im 21. Jahrhundert noch zu der gefährlichsten Infektionskrank- heit, die von einem Parasiten übertragen wird. Auch wenn Malaria in den 1950er Jahren mit Hilfe von Kontrollprogrammen und dem Einsatz von Insektiziden aus Europa, Australien und den USA verbannt werden konnte, ist sie heutzutage noch in mindestens 104 Ländern en- demisch (WHO 2010a).

Abb. 1: Länder und Regionen im Jahre 2009, in denen das Risiko einer Infektion mit dem MalariaErreger bestand (WHO 2010b)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Nach Angaben der Weltgesundheitsbehörde (WHO 2010a) treten jährlich etwa 250 bis 500 Millionen Krankheitsfälle auf, wobei die auch Sumpffieber genannte Tropenkrankheit, über eine Millionen Menschenleben fordert. Die meisten dieser Todesfälle (etwa 90 %) ereignen sich auf dem afrikanischen Kontinent, wobei Kinder unter 5 Jahren und Schwangere zur größten Risikogruppe gehören (WHO 2010a). Dabei sind hauptsächlich Menschen betroffen, die in Armut leben. Der Beginn eines Teufelskreises, der beispielsweise durch den Rückgang des Bruttoinlandproduktes um 1 bis 5 % betroffener Regionen, wie z.B. subsaharischer Staaten Afrikas (Gallup and Sachs 2001) weiter angetrieben wird.

Bei dem Erreger der Malaria handelt es sich um einzellige Protozoen der Gattung Plasmodium. Von den über 200 bekannten Arten, die eine Vielzahl von Wirtsorganismen befallen, sind hauptsächlich vier Spezies infektiös für den Menschen: P. falciparum, P. vivax,

P. ovale und P. malariae. Obwohl die vom P. vivax verursachte Malaria tertiana, die am häufigsten vorkommende Verlaufsform der Krankheit ist, verursacht die von P. falciparum ausgelöste Malaria tropicana, die meisten tödlichen Infektionen (WHO 2010a). Vor kurzem wurde in Malaysia eine fünfte für den Menschen bedrohliche Art entdeckt. In einem Todesfall wurde nachgewiesen, dass P. knowlesi von Affen auf Menschen übertragen werden und im menschlichen Wirt zum Tod führen kann (Cox-Singh, Hiu et al. 2010).

Malaria wird zwar von Plasmodien ausgelöst, ist aber eine sog. Vektor-übertragene Krankheit, bei der die Übertragung von Mensch zu Mensch über weibliche Stechmücken der Gattung Anopheles erfolgt. In Afrika gibt es hauptsächlich zwei Moskitoarten, Anopheles gambiae und Anopheles funestus, die für die Infektion von Menschen mit dem Parasiten verantwortlich sind. Die A. gambiae -Weibchen sind hocheffiziente und sehr gut angepasste Malariavektoren. Sie ernähren sich von Pflanzensäften, nach einer Befruchtung benötigen sie jedoch zusätzliche menschliche oder tierische Blutmahlzeiten, um Ovarien ausbilden zu können. Mit über 30 Tagen besitzen A. gambiae Moskitos eine relativ lange Lebensspanne, wodurch sie in der Lage sind, nach der Blutmahlzeit an einer einzelnen infizierten Person, Malaria an weitere hunderte von Menschen zu übertragen (Pierce and Miller 2009).

Im Zuge der WHO-Kampagne „ The Global Malaria Eradication Program “ hatte der Einsatz von Insektenbekämpfungsmitteln wie DTT, welches sich gegen die Moskitos richtet, und Pharmazeutika wie Chloroquin, das sich gegen die Parasiten wendet, Resistenzbildungen zur Folge, die u.a. für die offizielle Einstellung des Programms im Jahr 1972 verantwortlich waren. In den letzten Dekaden, hatte dies ein erneutes Aufflammen der Infektion zur Folge, und damit, einen rapiden Anstieg malariabedingter Todesfälle. In großen Teilen Afrikas liegt das Therapieversagen von medizinischen Präparaten wie Chloroquin oder Sulfadoxin- Pyrimethamin, mittlerweile schon bei 50 % (Vestergaard, Ringwald 2007; WHO 2009). Logis- tische Herausforderungen, wie die effektive ärztliche Behandlung von Menschen, die in ext- remer Armut und in abgelegenen ländlichen Gebieten leben, wirken zusätzlich beeinträchti- gend. Im vergangenen Jahr 2009, äußerte Dr. Delia Bethell vom U.S. Armed Forces Research Institute of Medical Science (AFRIMS), die klinische Studien in der Provinz Pailin in West- kambodscha leitet, dass bis zu 50 % ihrer 90 Patienten, drei Tagen nach der Behandlung mit Artesunat, einem weltweit gegen Malaria genutzten Arzneistoff, weiterhin positiv auf den Malaria-Erreger getestet wurden, einige sogar noch nach fünf Tagen. Sie deutete dies als Hinweis auf eine Resistenzentwicklung gegen Artesunat (McGivering 2009). In einem Artikel der Associated Press, der Anfang dieses Jahres veröffentlich wurde, bestätigte Dr. Bethell die Befürchtungen und äußert, dass die Ursache für die Resistenzbildung, der falsche Gebrauch Artesunats über einen zu lange Zeitraum sei (Mendoza und Mason 2010). Diese Rückschläge verleiten einige Forscher nach innovativen und teilweise überra- schenden Strategien zu suchen, um Malaria endlich eliminieren zu können. Der Astrophysi- ker Jordin Kare arbeitet beispielsweise an einem Laserstrahl, der spezifisch Anopheles - Mücken töten soll (Dambeck & Zyga, 2009). Experten der internationalen Atomenergiebe- hörde (IAEA) verfolgen einen anderen Ansatz: sie wollen männliche Mücken mittels radioak- tiver Strahlung sterilisieren und somit die Vermehrung des Vektors unterbinden (Reuters, 2004).

Darüber hinaus wird aber auch weiterhin global an weniger exotischen Methoden ge- forscht, die darauf abzielen eine Infektion mit dem Parasiten sowie dessen Übertragung zu unterbinden. Ansätze die sich mit der Vektorkontrolle beschäftigen, wie die Herstellung transgener Anopheles -Mücken, die antiparasitische Gene exprimieren (Ito, Ghosh et. al 2002), die Nutzung von insektizidbehandelten Moskitonetzen oder der Einsatz DTTs inner- halb von Gebäuden (WHO 2010a), stellen neben der Entwicklung eines Impfstoffes gegen Malaria, die primären Interventionsmethoden von betroffenen Kommunen zur Reduktion der Malaria-Transmission dar. Derzeitig befinden sich über 50 Malaria-Vakzinkandidaten in den verschiedensten Stufen klinischer Phasen (Richie & Parekh, 2009). Bei den meisten han- delt es sich um Untereinheit-Vakzine, die von einem oder von wenigen Antigenen abgeleitet worden sind und sich gegen eine bestimmte Stufe im Lebenszyklus des Parasiten richten. Da einzelne Antigene anscheinend jedoch keine ausreichend starke und schützende Immun- antwort auslösen können, werden außerdem auch Ansätze erforscht, die darauf abzielen, einen multivalenten, mehrstufigen Impfstoff zu generieren (Richie und Parekh, 2009).

1.1 Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum

Der Lebenszyklus der Malaria-Erreger wird exemplarisch für Plasmodium falciparum in der nachfolgenden Abbildung aufgezeigt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Der Lebenszyklus von P. falciparum. Die schematische Darstellung zeigt den Lebenszyklus des Malaria-Erregers P. falciparum sowie Möglichkeiten zum Einsatz von Impfstoffen. Die einzelnen Entwicklungs- stadien des Parasiten, die im Moskito sowie im Menschen stattfinden, sind mit unterschiedlichen Farben ge- kennzeichnet, um die drei Hauptphasen des Plasmodium -Lebenszyklus voneinander abzugrenzen. Es wird un- terschieden zwischen der präerythrozytären Phase, die in der Leber stattfindet, der erythrozytären Phase, die sich in roten Blutzellen ereignet, sowie der sexuellen Phase, die in den Mücken erfolgt (Malaria Vaccine Initiati- ve, 2010).

Wenn eine weibliche Anopheles -Mücke die Haut eines Menschen penetriert, um eine Blutmahlzeit zu sich zu nehmen, injiziert sie eine Mischung aus Speichelflüssigkeit und einem Antikoagulans (McGraw-Hill, 2009). Ist der Moskito mit Plasmodien infiziert, so erfolgt auch die Injektion von beweglichen spindel-förmigen asexuellen Zellen, den Sporozoiten, in den Blutkreislauf (1). Die Sporozoiten wandern zur Leber, in der sie Hepatozyten befallen und durch Invagination der Zellmembran eindringen, wobei die Leberzellen nicht zerstört werden (2). Es kommt zu asexuellen Teilungen des Parasiten. Diese sog. Schizogenie endet nach un- gefähr 7 bis 10 Tagen mit der Freisetzung von Vesikeln, die die Merozoiten, eine birnen- förmige Zwischenform des Parasiten, enthalten (3). Die auch Merosomen genannten Vesikel platzen auf und entlassen bis zu 30.000 Merozoiten in die Blutbahn (Patarroyo, 2008), in der diese Erythrozyten befallen und in sie eindringen (4). Es beginnt der erythrozytäre Zyklus, in dem die Merozoiten proliferieren und sich über das Ring- und Trophozoitenstadium zum Schizonten entwickeln. Nach ungefähr 48 Stunden ist die intraerythrozytäre Entwicklung des Parasiten abgeschlossen. Die roten Blutzellen platzen auf und der Schizont entlässt neue Merozoiten, die wiederum neue Erythrozyten befallen. Der erythrozytäre Zyklus beginnt von vorne (5). Neben den Merozoiten werden aber auch pyrogene Substanzen freigesetzt, die sich im Körper des Wirts verteilen und das für Malaria typische Wechselfieber verursachen (McGraw-Hill, 2009).

Einige der infizierten Erythrozyten verlassen den Kreislauf der asexuellen Replikation und entwickeln sich zur sexuellen Form des Parasiten - den Gametozyten (6). Um Gameten produzieren zu können, müssen die Gametozyten aber durch den Biss eines Moskitos aus dem menschlichen Wirt aufgenommen werden. Denn die Entwicklung zu den Gameten erfolgt erst im Darmtrakt der Mücke (7). Befruchtete Gameten entwickeln sich zu beweglichen Ookineten (8), die sich in die Mitteldarmwand bohren und zu Oozysten differenzieren. In diesem Entwicklungsstadium finden sich wiederholende mitotische Teilungen statt, durch die tausende von aktiven Sporozoiten entstehen. Durch das Aufplatzen der Oozysten gelangen die Sporozoiten in den Hohlraum des Mückenkörpers, von wo aus sie zu den Speicheldrüsen migrieren (8). Dieser Infektions-Zyklus wiederholt sich, sobald die Anopheles -Mücke einen weiteren Menschen für eine neue Blutmahlzeit sticht (10).

1.2 Blutstadien-Antigene und ihre Bedeutung für die Vakzinentwicklung

Da die Erkrankung nur in der erythrozytären Phase der Infektion einen klinisch mani- festierten Verlauf zeigt, sowie aufgrund von Studien an Tiermodellen und epidomologischen Studien, die klar aufzeigen konnten, dass Immunantworten gegen sog. Blutstadien-Antigene Schutz gegen die Erkrankung induzieren oder die Kontrolle der Parasitämie beschleunigen (Mitchell, Butcher et al. 1976), scheint es begründet zu sein, diese potentiellen Impfstoff- kandidaten in die Entwicklung eines (multivalenten) Vakzins mit einzubeziehen. Immunisie- rungsversuche mit Blutstadien-Antigenen, wie MSP142 und MSP119 konnten in Tiermodellen zeigen, dass sie Schutz vermitteln können (Richards and Beeson 2009). Darüber hinaus hatte ein Kombination B-Vakzin, bestehend aus MSP2 und MSP1, einen schützenden Effekt bei menschlichen Probanden (Genton, Betuela et al. 2002). Zurzeit sind die führenden Blutstadi- en-Vakzinkandidaten alles Proteine, die entweder auf der Oberfläche dieser parasitären Zwi- schenform zu finden sind, oder sich im Inneren der apikalen Organellen befinden (s. Abb. 3).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3. Die Struktur eines Merozoiten und die wichtigsten Moleküle, die an der ErythrozytenInvasion beteiligt sind (Patarroyo and Patarroyo 2008). Am apikalen Ende der Merozoiten befinden sich Organellen, sog. Rhoptrien und Mikronemen, die Proteine beinhalten, die an der Interaktion zwischen Wirt und Parasit beteiligt sind und diese im Laufe der Invasion freisetzen. Darüber hinaus verfügt ein Merozoit über dichte Granula, und einen Apikoplasten (Plastid-Überbleibsel). Antigene, die potentiellen Impfstoffcharakter besitzen, kommen auf der Oberfläche, sowie in den Organellen der Merozoiten vor. Oberflächen-Proteine können einen GPI-Anker besitzen, oder mit Proteinen, die einen besitzen, assoziiert sein. Aufgelistet sind bekannte intra- und extrazelluläre Antigene der Merozoiten (Richards and Beeson 2009).

Trotz vieler Fortschritte gelang es bisher noch nicht einen effektiven Impfstoff zu entwickeln. Ein größerer Forschungsaufwand, sowie eine höhere finanzielle Unterstützung, würden die Entwicklung und Evaluation von neuen Impfstoffkandidaten beschleunigen. In letzter Zeit werden wieder vermehrt Strategien vorgestellt, die es sich zum Ziel setzen, Mala- ria endlich zu eliminieren (Feachem and Sabot 2008). Ein effektiver Impfstoff wird dabei, zusätzlich zu den bekannten Methoden, sehr wahrscheinlich notwendig sein, um eine Elimi- nierung der Malaria zu erreichen. Betont wird dabei zur Zeit, dass es nicht ausreicht, lediglich die klinische Erkrankung des Sumpffiebers zu verhindern, sondern dass ebenfalls die Mala- riatransmission reduziert werden muss (WHO 2010). Blutstadien-Impfstoffe bewirken nicht nur den Rückgang der Parasitämie und die Prävention eines klinischen Krankheitsverlaufs, darüber hinaus scheint eine niedrige Parasitendichte die Entstehung von Gametozyten in der Blutbahn zu reduzieren (Richards and Beeson 2009). Deswegen ist anzunehmen, dass ein effektives Blutstadien-Vakzin zusätzlich zu einer Reduzierung der Parasitenübertragung führt (Richards and Beeson 2009).

Die wohl größte Herausforderung, bei der Entwicklung eines Blutstadien-Vakzins, liegt darin, den hohen Grad an Antigen-Diversität zu überwinden. Denn die meisten wichti- gen Antigene zeigen einen erheblichen Polymorphismus (Miller, Roberts et al. 1993; Volkman, Hartl et al. 2002). Darüber hinaus hat der Parasit es geschafft Strategien zu entwi- ckeln, die es erlauben, dass menschliche Immunsystem zu täuschen oder es zu umgehen (Malaria Vaccine Initiative 2009). In diesem Zusammenhang konnten BAUM et al. (2005) durch das Ausschalten des Gens für den Liganden PfRh2b, der bei der Invasion eine Schlüs- selrolle zu spielen scheint, zeigen dass der Parasit einen neuen, zuvor von dem dominanten PfRh2b maskierten, Invasions-Weg einschlägt und schlossen daraus, dass Interaktionen, die die Invasion ermöglichen hierarchisch organisiert sind. Derartige Mechanismen ermöglichen dem Parasiten sich an die Vielfalt der Erythrozyten-Oberflächenrezeptoren zu adaptieren und eine Immun-gesteuerte Wirtsselektion zu vermeiden (Baum et. al 2005).

Allerdings ist der Grad des Polymorphismus für einige Antigene weniger hoch bzw. besitzen viele Proteine Domänen oder Regionen, die weniger polymorph oder konserviert sind. Diese Plasmodium -Antigene könnten geeignete Ziele für Impfstoffe sein, um das Problem der genetischen Variabilität zu überwinden.

1.3 Merozoit-Oberflächen-Protein 1

Das Merozoit-Oberflächen-Protein 1 (MSP1) ist eines der am besten charakterisierten Blutstadien-Antigene und ein führender Impfstoffkandidat, da Oberflächenproteine der Merozoiten die Synthese von Antikörpern stimulieren können, die mit der Invasion der Erythrozyten interferieren (Kauth, Epp et al. 2003). MSP1 besitzt ein Molekulargewicht von etwa 195 kDa und ist das am häufigsten auf der Merozoit-Oberfläche vorkommende GPIverankerte Protein. Eine schematische Darstellung MSP1-Domänen bzw. -Fragmente ist in der nachfolgenden Abbildung 4 gezeigt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Übersicht über die Proteindomänen und polymorphen Regionen des MSP1. MSP1 verfügt über ein N-terminales Signalpeptid (SP) sowie einen C-terminalen GPI-Anker, die die hintereinander gestaffelten Proteindomänen MSP183, MSP130, MSP138, MSP133 und MSP119 (MSP142) flankieren. Die antigenische Variabilität wird ebenfalls aufgezeigt, wobei (semi)konservierte (hellgrau), oligo- (schraffiert) und dimorphe (dunkelgrau) Bereiche farblich unterschieden werden.

MSP1 wird vor dem Eindringen in die Erythrozten in zwei voneinander unabhängigen Schritten, prozessiert. In dem ersten Prozessierungsschritt wird MSP1 proteolytisch von der Subtilisin-ähnlichen Protease PfSUB1 in vier Fragmente aufgespalten (Woehlbier, Epp et al. 2010), darunter auch das 42 kDa-Fragment MSP142. Nach der ersten Spaltung liegen diese vier Fragmente nicht-kovalent assoziiert vor und interagieren mit prozessierten Domänen von MSP6 und MSP7 welche ebenfalls peripher auf der Oberfläche des Parasiten gebunden sind (Woehlbier, Epp et al. 2010). Die Invasion der roten Blutkörperchen ereignet sich erst nach einem zweiten Prozessierungsschritt, bei dem MSP142 in das N-terminale MSP133 und das C-terminale, Membran-gebundene MSP119 getrennt wird. MSP133 wird dabei gemeinsam mit dem restlichen Teil des MSP1/6/7-Komplexes während des Eindringens in die roten Blut- zellen abgeworfen. MSP119 hingegen bleibt an die Merozoiten gebunden und wird im Verlauf der Erythrozyten-Invasion internalisiert (Richie und Parekh, 2009).

In Feldisolaten konnten zwei bedeutende allelische Varianten von MSP1 identifiziert werden, die als 3D7 (oder MAD20) und Wellcome (oder K1) bezeichnet werden (Tanabe, Mackay et al. 1987). MSP133 ist dabei mit einer Homologie von nur 47% zwischen 3D7 und Wellcome, deutlich variabler als MSP119, das sehr hochkonserviert bei beiden allelischen Typen vorliegt und sich nur in wenigen Aminosäuren unterscheidet.

1.4 MSP119 als Impfstoffkandidat

MSP119 ist das am stärksten konservierte Fragment von MSP1. Es enthält 12 Cysteine, die durch je drei Disulfidbrücken, zwei EGF-ähnliche Domänen ausbilden (siehe Abb. 5). Antikörper, die spezifisch gegen die C-terminale

Proteindomäne binden, konnten in vielen Versuchsreihen sowohl in vitro die Invasion von Erythrozyten verhindern (Guevara Patino, Holder et al. 1997), als auch in vivo passive Immunität auf Nagetiere übertra- gen (Burns, Flaherty et al. 2004). Darüber hinaus korrelieren sie mit der Resistenz gegen klinische Malaria (Branch, Udhayakumar et al. 1998). Diese Erkennt- 1st EGF

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 5: Tertiärstruktur von MSP119. In rot werden die sechs Disulfidbrücken dargestellt, die die beiden EGF-ähnlichen Domänen zusammenhalten

nisse definieren MSP119 als das kleinste MSP1-Fragment, das noch einen immunologischen Schutz vermitteln kann und machen es deshalb zu einem interessanten Impfstoffkandidaten. Der größte Nachteil von MSP119 liegt jedoch darin, dass es über keine potenten T-Zell- Epitope verfügt, um alleine starke Immunantworten auszulösen (Udhayakumar, Anyona et al. 1995). Das konnte u.a. in Studien mit Nachtaffen (Aotus) gezeigt werden, in denen sich MSP142 als viel immunogener und schützender herausstellte, als MSP119 alleine (Stowers, Cioce et al. 2001; Darko, Angov et al. 2005). In diesem Zusammenhang konnten EGAN et al. (1997) in Experimenten mit Spenderzellen zeigen, dass MSP119 über T-Zell-Epitope verfügt, diese jedoch von seinen Disulfidbrücken maskiert werden. In Kontrollen zeigten zuvor redu- zierte rekombinante MSP119-Varianten, dass sie sowohl die Bildung von INF-γ erhöhen, als auch das Ausmaß der zellulären Immunanwort.

Die nachfolgende Tabelle liefert eine Übersicht der klinischen Studien, die kürzlich erst abgeschlossen wurden bzw. noch laufen, und in denen MSP119 gemeinsam mit AMA1, oder als Teil von MSP142 als Impfstoffkandidat untersucht wird/wurde.

[...]

Ende der Leseprobe aus 97 Seiten

Details

Titel
Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten
Hochschule
Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen  (Institut für Molekulare Biotechnolgie)
Note
1,0
Autor
Jahr
2010
Seiten
97
Katalognummer
V358437
ISBN (eBook)
9783668434165
ISBN (Buch)
9783668434172
Dateigröße
3041 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Malaria-Impfstoff, Plasmodium falciparum, MSP1, MSP1-19 basierte Impfstoffe, Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzen, Plant Molecular Farming, Pflanzenbiotechnologie
Arbeit zitieren
Güven Edgü (Autor), 2010, Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/358437

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