Optische Mikroskope sind eine der wenigen Möglichkeiten, um lebende Organismen zu untersuchen. Ihre Auflösungsfähigkeit ist jedoch durch Beugungseffekte auf einige hundert Nanometer begrenzt, sodass molekulare Strukturen lange Zeit im Verborgenen blieben. Durch das Markieren bestimmter Arten von Proteinen mit fluoreszenten Molekülen ist es jedoch gelungen, Aussagen über molekulare Strukturen in der Größenordnung weniger Nanometer zu treffen und das Zellinnere näher zu erforschen. Bei diesem Versuch werden wir die Methode des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) kennenlernen und anwenden, um Proteinabstände in einigen Proben menschlicher HeLa-Zellen zu bestimmen und die in dem Prozess auftretenden Fehlerquellen zu untersuchen.
Inhaltsverzeichnis
- Zielstellung des Versuches
- Theoretischer Hintergrund
- Fragen zur Vorbereitung
- „Wie kommt man bei einer Dipol-Dipol-Wechselwirkung zum FRET-Effekt? Was bedeutet der Försterradius?"
- „Was passiert, wenn Donor und Akzeptor feste Orientierungen haben? Welche Grenzfälle gibt es? Kann es auch FRET vom Akzeptor auf den Donor geben?"
- Warum kann man nicht einfach den Donor anregen und schauen ob im Spektralbereich des Akzeptors Licht detektierbar ist? Nötige Korrekturen?
- Geht das Experiment nur mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop? Alternativen?
- \"Was passiert, wenn man anderes Objektiv nimmt?"
- Welchen Abstand sollten PH-CFP und PH-YFP haben um FRET zu sehen?
- „Warum verändert sich die FRET-Effizienz, wenn man die Lipase aktiviert?"
- Versuchsaufbau und Messtechniken
- Messprotokoll
- Kamerarauschen und Identifikation von Fehlerquellen
- Einstellung der Feldblende
- Köhlerbeleuchtung
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Dieses Praktikum beschäftigt sich mit der Methode des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) und deren Anwendung bei der Bestimmung von Proteinabständen in menschlichen HeLa-Zellen. Das Hauptziel ist es, die Funktionsweise des FRET-Effekts zu verstehen und die dazugehörigen Messtechniken anzuwenden.
- Anwendung des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) in der Zellbiologie
- Bestimmung von Proteinabständen mit FRET
- Einfluss von Fehlerquellen auf die FRET-Effizienz
- Die Rolle von Fluoreszenzfarbstoffen als Donor und Akzeptor
- Experimentelle Techniken mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop
Zusammenfassung der Kapitel
Das Kapitel "Zielstellung des Versuches" führt in die Thematik des Versuchs ein und erläutert das Ziel, Proteinabstände in HeLa-Zellen mit Hilfe des FRET-Effekts zu bestimmen. Der "Theoretische Hintergrund" erklärt die Funktionsweise des FRET-Effekts, beschreibt die beteiligten Farbstoffe und stellt den Försterradius als Maß für den Abstand zwischen Donor und Akzeptor vor.
Das Kapitel "Fragen zur Vorbereitung" befasst sich mit verschiedenen Aspekten der FRET-Methode, beispielsweise mit der Dipol-Dipol-Wechselwirkung, der Orientierung von Donor und Akzeptor und der Notwendigkeit von Korrekturen bei der Datenanalyse. Der Abschnitt "Versuchsaufbau und Messtechniken" beschreibt die verwendeten Geräte und Messmethoden, inklusive des Epi-Fluoreszenzmikroskops. Schließlich beschreibt das Kapitel "Messprotokoll" die Schritte und Einstellungen, die während des Versuchs durchgeführt werden, wie z.B. die Analyse des Kamerarauschens, die Identifikation von Fehlerquellen und die Durchführung von Ausbleichreihen.
Schlüsselwörter
Die Schlüsselwörter dieses Praktikums sind Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), Fluoreszenzfarbstoffe, Donor, Akzeptor, Försterradius, HeLa-Zellen, Proteinabstände, Epi-Fluoreszenzmikroskop, Sensitized Emission, Kamerarauschen, Ausbleichen, Fehlerquellen.
Häufig gestellte Fragen
Was bedeutet FRET in der Physik/Biologie?
FRET steht für Förster-Resonanzenergietransfer, eine Methode zur Bestimmung molekularer Abstände im Nanometerbereich mittels Fluoreszenz.
Was ist der Försterradius?
Der Försterradius ist der Abstand zwischen Donor und Akzeptor, bei dem die Energieübertragungseffizienz genau 50 % beträgt.
Welche Zellen werden im Versuch untersucht?
Der Versuch nutzt menschliche HeLa-Zellen, um Proteinabstände experimentell zu bestimmen.
Was sind Donor und Akzeptor beim FRET?
Es sind fluoreszente Moleküle (Farbstoffe), wobei der Donor Energie an den Akzeptor überträgt, wenn diese nah genug beieinander liegen.
Welche Fehlerquellen gibt es bei FRET-Messungen?
Zu den Fehlerquellen zählen Kamerarauschen, das Ausbleichen der Farbstoffe (Photobleaching) und die Orientierung der Moleküle.
- Quote paper
- Moritz Lehmann (Author), Niklas Stenger (Author), 2017, Förster-Resonanzenergietransfer. Physikalisches Praktikum für Fortgeschrittene, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/378242
