Der Versuch G-03 befasst sich schwerpunktmäßig mit drei Aspekten. Es handelt sich um das Enzym „Urease“. Weiterhin steht der optische Test im Mittelpunkt des Versuches. Weiterhin wird in weiteren Verlauf die Methode nach Bradford angewandt.
Bei der Urease (Harnstoff-Amidohydrolase) handelt es sich um ein Enzym, welches als Desaminase die Hydrolyse von Harnstoff katalysiert. Dabei entstehen die primären Produkte Carbaminsäure und Ammoniak. Im weiteren Verlauf zerfällt die Carbaminsäure spontan zu Ammoniak und Kohlensäure. Das Enzym kehrt die Eliminierung des Harnstoffs um in eine Hydrolyse.
Ureasen sind Nickel-Enzyme, da Nickel-Atome im aktiven Zentrum vorhanden sind, genauer gesagt handelt es sich um ein 2-Nickel-Zentrum. Die Nickel-Ionen werden über die carbamylierte Seitenkette eines Lysinrestes (Lys 220) und über ein Wassermolekül auf der anderen Seite überbrückt. Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird im Versuch G-03 das Verfahren des gekoppelten optischen Tests mit Glutamatdehydrogenase (GLDH) verwendet. Die Methode wurde 1936 von Otto Warburg eingeführt. In diesem Verfahren wird neben der Harnstoffzersetzung durch Urease eine zweite enzymatische Reaktion mit der GLDH parallel laufen gelassen. Dabei werden α-Ketoglutarat und NADH in Abhängigkeit von Ammonium zu Glutamat und NAD+ umgesetzt. Das in der ersten Reaktion gebildete Ammonium findet als Substrat Verwendung in der zweiten Reaktionen. Die Besonderheit an diesen zwei Reaktionen liegt in den verschiedenen Absorptionsspektren der Substrate und Produkte. NAD+ besitzt ein Absorptionsmaximum bei 260 nm, NADH hingegen besitzt zwei Absorptionsmaxima, und zwar bei 340 nm und bei 260 nm. Dies bedeutet, dass die Reaktionen, an denen die GLDH teilnimmt, über das Erscheinen und Verschwinden der Absorptionsbanden bei 340 nm messbar sind. Die Messung dient dann als Maß für den Reduktionsgrad von NAD+.
Zur Ermittlung der spezifischen Aktivität der Urease, muss die Menge an isoliertem Protein in den Proben ermittelt werden. Dazu wird die Methode nach Bradford verwendet. Bei dem Bradford-Assay handelt es sich um eine kolorimetrische Methode zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Kern des Assays ist, dass die Bindung von Coomassie Brilliant Blue an ein Protein in saurer Lösung die Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs von 465 nm nach 595 nm verursacht. Daher ist die Absorption bei 595 nm in einem Bradford-Assay ein direktes Maß für die Proteinkonzentration.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Durchführung
3 Auswertung
4 Diskussion
5 Literaturverzeichnis
Zielsetzung & Themen der Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die praktische Isolierung und biochemische Charakterisierung des Enzyms Urease, um dessen kinetische Eigenschaften unter variierenden Substratkonzentrationen zu bestimmen und die Proteinkonzentration mittels eines Bradford-Assays zu ermitteln.
- Strukturelle Analyse und Funktionsweise von Nickel-Enzymen (Urease)
- Messung der Enzymkinetik durch gekoppelte optische Tests (GLDH-Methode)
- Mathematische Auswertung der Kinetik nach Michaelis-Menten und Lineweaver-Burk
- Bestimmung der Proteinkonzentration mittels kolorimetrischer Bradford-Analyse
- Berechnung der enzymspezifischen Aktivität
Auszug aus dem Buch
1 Einleitung
Der Versuch G-03 befasst sich schwerpunktmäßig mit drei Aspekten, die in der Einleitung genauer beschrieben werden sollen. Dabei handelt es sich um das Enzym „Urease“, das als ersten vorgestellt und erläutert wird. Weiterhin steht der optische Test im Mittelpunkt des Versuches, weshalb dieser in einem zweiten Schritt erklärt wird. Weiterhin wird in weiteren Verlauf die Methode nach Bradford angewandt, weshalb auch diese in der Einleitung Aufmerksamkeit erhält.
Bei der Urease (Harnstoff-Amidohydrolase) handelt es sich um ein Enzym, welches als Desaminase die Hydrolyse von Harnstoff katalysiert. Dabei entstehen die primären Produkte Carbaminsäure und Ammoniak. Im weiteren Verlauf zerfällt die Carbaminsäure spontan zu Ammoniak und Kohlensäure.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Dieses Kapitel stellt das Enzym Urease vor, erläutert die enzymatische Hydrolyse von Harnstoff und führt die angewandten Untersuchungsmethoden (optischer Test und Bradford-Assay) ein.
2 Durchführung: Hier werden die experimentellen Schritte zur Probenvorbereitung, die Durchführung der enzymatischen Messungen bei verschiedenen Harnstoffkonzentrationen und die Durchführung des Bradford-Assays detailliert beschrieben.
3 Auswertung: In diesem Kapitel werden die experimentellen Daten in Tabellen und Graphen aufbereitet, die Michaelis-Menten- und Lineweaver-Burk-Diagramme erstellt sowie die spezifischen Aktivitäten des Enzyms berechnet.
4 Diskussion: Das Kapitel reflektiert die methodischen Vor- und Nachteile der kinetischen Darstellungsformen und erörtert mögliche Fehlerquellen bei der Bestimmung von v_max und K_M.
5 Literaturverzeichnis: Auflistung der verwendeten Skripte und Fachliteratur zur biochemischen Einordnung der Versuche.
Schlüsselwörter
Urease, Harnstoff, Enzymkinetik, Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Bradford-Assay, Photometrie, Nickel-Zentrum, Desaminase, Proteinkonzentration, spezifische Aktivität, Reaktionsgeschwindigkeit, Substratkonzentration, Optischer Test, Biochemie
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit dokumentiert einen biochemischen Praktikumsversuch zur Isolierung und Charakterisierung des Enzyms Urease.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themen sind die Enzymkinetik, die mathematische Modellerstellung zur Reaktionsgeschwindigkeit und die quantitative Bestimmung von Proteinen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel ist die Bestimmung der kinetischen Parameter (v_max und K_M) der Urease sowie deren spezifische Aktivität unter definierten Laborbedingungen.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Es werden der gekoppelte optische Test nach Warburg unter Verwendung von Glutamatdehydrogenase (GLDH) sowie der Bradford-Assay zur Proteinbestimmung angewandt.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil umfasst die detaillierte Versuchsdurchführung, die tabellarische und grafische Auswertung der Extinktionsmessungen sowie die mathematische Herleitung der Michaelis-Menten-Parameter.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit wird maßgeblich durch die Begriffe Urease, Enzymkinetik, Michaelis-Menten-Diagramm und Bradford-Assay geprägt.
Warum wird für die Kinetik ein Lineweaver-Burk-Diagramm erstellt?
Das Diagramm dient als Linearisierungsmethode, um aus den experimentellen Daten zuverlässigere Schätzwerte für die Parameter v_max und K_M zu extrahieren, da die Michaelis-Menten-Kurve eine nicht-lineare Darstellung ist.
Was zeigt das Bradford-Assay Ergebnis?
Das Bradford-Assay liefert über eine Eichgerade mit BSA (Bovines Serumalbumin) die notwendigen Daten, um die Konzentration der isolierten Urease in den Proben präzise zu bestimmen.
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- Anita Greinke (Author), 2016, Versuch zur Isolierung und Charakterisierung von Urease (Harnstoff-Amidohydrolase), Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/378401
