Versuch zur Isolierung und Charakterisierung von Urease (Harnstoff-Amidohydrolase)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Durchführung

3 Auswertung

4 Diskussion

5 Literaturverzeichnis

1 Einleitung

Der Versuch G-03 befasst sich schwerpunktmäßig mit drei Aspekten, die in der Einleitung genauer beschrieben werden sollen. Dabei handelt es sich um das Enzym „Urease“, das als ersten vorgestellt und erläutert wird. Weiter­hin steht der optische Test im Mittelpunkt des Versuches, weshalb dieser in einem zweiten Schritt erklärt wird. Weiterhin wird in weiteren Verlauf die Me­thode nach Bradford angewandt, weshalb auch diese in der Einleitung Auf­merksamkeit erhält.

Bei der Urease (Harnstoff-Amidohydrolase) handelt es sich um ein En­zym, welches als Desaminase die Hydrolyse von Harnstoff katalysiert. Dabei entstehen die primären Produkte Carbaminsäure und Ammoniak. Im weiteren Verlauf zerfällt die Carbaminsäure spontan zu Ammoniak und Kohlensäure.

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Abb. 1: Katalysierte Reaktion der Urease.

Das Enzym kehrt die Eliminierung des Harnstoffs um in eine Hydrolyse.

Ureasen sind Nickel-Enzyme, da Nickel-Atome im aktiven Zentrum vorhan­den sind, genauer gesagt handelt es sich um ein 2-Nickel-Zentrum, wie den Abbildun­gen 2 und 3 entnommen werden kann. Die Nickel-Ionen werden über die carbamylierte Seitenkette eines Lysinrestes (Lys 220) und über ein Wassermolekül auf der anderen Seite überbrückt.

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Abb. 2: Darstellung von Urease (2011.igem.org) Abb. 3: Strukturformel von Urease (www.hindawi.com)

Zur Bestimmung der Enzymaktivität wird im Versuch G-03 das Verfahren des gekoppelten optischen Tests mit Glutamatdehydrogenase (GLDH) verwendet. Die Methode wurde 1936 von Otto Warburg eingeführt. In diesem Verfahren wird neben der Hamstoffzersetzung durch Urease eine zweite enzymatische Reaktion mit der GLDH parallel laufen gelassen. Dabei werden a-Ketoglutarat und NADH in Abhän­gigkeit von Ammonium zu Glutamat und NAD+ umgesetzt.

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Abb. 4: Reaktionen von Urease und GLDH; gekoppelt optischer Test.

Das in der ersten Reaktion gebildete Ammonium findet als Substrat Verwendung in der zweiten Reaktionen. Die Besonderheit an diesen zwei Reaktionen liegt in den ver­schiedenen Absorptionsspektren der Substrate und Produkte. NAD+ besitzt ein Ab­sorptionsmaximum bei 260 nm, NADH hingegen besitzt zwei Absorptionsmaxima, und zwar bei 340 nm und bei 260 nm. Dies bedeutet, dass die Reaktionen, an denen die GLDH teilnimmt, über das Erscheinen und Verschwinden der Absorptionsbanden bei 340 nm messbar sind. Die Messung dient dann al Maß für den Reduktionsgrad von NAD+. Damit das Verfahren erfolgreich ist, muss auf die Bedingungen geachtet wer­den, denn es gilt, dass das Gleichgewicht auf der rechten Seite liegt und die Ureasereaktion somit geschwindigkeitsbestimmend ist.

Zur Ermittlung der spezifischen Aktivität der Urease, muss die Menge an iso­liertem Protein in den Proben ermittelt werden. Dazu wird die Methode nach Bradford verwendet. Bei dem Bradford-Assay handelt es sich um eine kolorimetrische Methode zur Konzentrationsbestimmung von Proteinen. Kem des Assays ist, dass die Bindung von Coomassie Brilliant Blue an ein Protein in saurer Lösung die Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs von 465 nm nach 595 nm verursacht. Daher ist die Absorption bei 595 nm in einem Bradford-Assay ein direktes Maß für die Protein­konzentration (vgl. Voet/Voet).

2 Durchführung

Zu Beginn des Versuches wurden die Hamstofflösungen und der Reagentienmix angesetzt. Die Harnstofflösungen wurden zu vorgegeben Lö­sungen (Skript S. 14) verdünnt. Die Stocklösung betrug 1 M (somit ergab sich, dass eine 0,7 M aus 700 μΐ Harnstoff und 300 μΐ Wasser angesetzt wurde). Der Reagentienmix wurde laut Versuchsvorschrift angesetzt (Skript S. 14). Weiter­hin wurden zwei Urease Lösungen mit unterschiedlicher Verdünnung ange­setzt. Für die Verdünnung von 1:20 wurden 5 μΐ Urease und 95 μΐ EDTA/DTA vermengt, für die Verdünnung von 1:100 dementsprechend 1 pl Urease und 99 pl EDTA/DTA.

Im Anschluss wurde eine UV Küvette mit der Urease-Verdünnung von 1:100, dem Reagentienmix, der GDLH-Lösung und Wasser (nach Skriptvor­schrift, S. 15) befüllt. Es wurden 50 pl 0,3 M Harnstofflösung in die Küvette gegeben und 10 s vermischt. Alle 15 Sekunden wurde die Extinktion bei 340 nm gemessen (Tab. 1). Anschließend wurde die Küvette mit bidestilliertem Wasser ausgewaschen und mit der Urease-Verdünnung von 1:20 und den rest­lichen Stoffen laut Skript (S. 15) befüllt. Es wurde der gleiche Versuchsablauf durchgeführt und die Extinktionen gemessen (Tab. 2).

Für die weitere Durchführung wurde die Ureaselösung mit einer Ver­dünnung von 1:20 verwendet, weil die Extinktionsänderung dort nach 180 s abgeschlossen war. Für die Aktivitätsbestimmung der isolierten Urease wurden acht Mischungen aus Reagentienmix, GLDH-Lösung, Wasser und der 1:20 Urease-Verdünnung angefertigt (Mengenangaben sind dem Skript zu entneh­men, S. 16). Anschließend wurden 50 pl einer bestimmten Harnstoffkonzentra­tion (Angabe erfolgte nach Skriptanweisung) in die Küvette hinzu pipettiert und die Extinktionen alle 15 s gemessen (Tab. 3-10 und Graph 1-8).

Im letzten Versuchsabschnitt wurden 9 Einmalküvetten nach dem Schema im Skript (S. 17) mit bidest. Wasser und einer BSA-Stocklösung befüllt und, nachdem 1000 pl Bradford Reagenz hinzugegeben wurden, die Extinktionen bei 595 nm nach einer Inkubationszeit von 5 min gemessen (Tab. 10). Weiterhin wurden 3 Küvetten nach dem Schema im Skript (S. 18) mit bidest. Wasser und der unverdünnten Urease-Lösung befüllt, mit 1000 pl Brad-
ford Reagenz versetzt und nach einer 5 minütigen Inkubationszeit die Extink­tionen bei 595 nm gemessen (Tab. 11).

3 Auswertung

In dem ersten Versuchsteil wurde die Kinetik der Urease untersucht. Für die weiteren Versuche wurde eine Verdünnung von 1:20 genutzt, da keine starke Extinktionsänderung im weiteren Verlauf zu vernehmen war. Die beiden Tabellen zeigen die Extinktionswerte bei 340 nm der beiden Verdünnungen.

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Graph 1: Absorption bei einer Ureaseverdünnung von 1:100

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Graph 2: Absorption bei einer Ureaseverdünnung von 1:20

Anhand der Einzeichnung bei 180 s kann klar der weitere Verlauf in Graph 2 als konstant bewertet werden, weshalb sich diese Extinktion als geeignet für den wei­teren Versuch herausstellte.

Im weiteren Versuchsablauf wurden die Extinktionen in Abhängigkeit von der Zeit für die Ureaseverdünnung von 1:20 bei unterschiedlichen Hamstoffkonzentratio- nen gemessen. Im Folgenden werden die acht tabellarischen Auswertungen angezeigt. Daraufhin erfolgt eine graphische Darstellung inklusive einer Auswertung der Daten mittels Regression.

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