Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor (Mehlwurm)

Inhaltsverzeichnis

1. Aufgabenstellung

2. Zusammenfassung

3. Abkürzungsverzeichnis

4. Einleitung
4.1 Rolle der TIM im Stoffwechsel
4.2 Regulation der Glycolyse
4.3 Triosephosphat-Isomerase in Insekten
4.4 Struktur der Triosephosphat-Isomerase
4.4.1 Aktives Zentrum
4.5 TIM-Genomorganisation (Introns und Exons)
4.5.1 Frühe-Intron-Theorie
4.5.2 Späte-Intron-Theorie
4.6 Sequenzierungsmöglichkeiten
4.7 Rekombinante Expression
4.8 Wahl des Organismus

5. Material
5.1 Geräte
5.2 Fein- und Biochemikalien
5.3 Verbrauchsmaterialien
5.4 Puffer
5.4.1 Standardpuffer
5.4.2 Puffer für Agarosegelelektrophorese
5.4.3 Puffer für die Aktivitätsbestimmung
5.4.4 Puffer für Einschlusskörper-Reinigung
5.4.5 Puffer für Polyacrylamidgelelektrophorese
5.4.6 Puffer für Affinitätschromatographie
5.4.6.1 Ni-NTA-Säule
5.4.6.2 9E10-Säule
5.5 Kits
5.6 Primer
5.7 Vektoren
5.8 Proteine
5.9 Stämme
5.10 Marker
5.11 Präparat
5.12 Medien
5.13 Software

6. Methoden
6.1 Nukleinsäure-Analytik
6.1.1 RNA-Präparation
6.1.2 cDNA-Synthese
6.1.3 cDNA-Amplifikation
6.1.4 Gelelektrophorese
6.1.5 PCR-Reinigung
6.1.6 Amplifikation der TIM-Sequenz
6.1.7 DNA-Präparation und Sequenzierung
6.1.8 RACE-PCR
6.2 Konstruktion, Transformation und Expression
6.2.1 pGP-S100 Vektor
6.2.1.1 Ligation und Transformation
6.2.1.2 Expression
6.2.2 pGP-ST2 Vektor
6.2.2.1 Ligation und Transformation
6.2.2.2 Expression
6.2.3 pCR T7/NT Vektor
6.2.3.1 Konstruktion und Reinigung des Inserts
6.2.3.2 Ligation und Transformation
6.2.3.3 Expression
6.3 Zellaufschluss
6.3.1 French Press
6.3.2 Ultraschall
6.4 Proteinfraktionierung
6.4.1 Probenvorbereitung
6.4.2 Totallysat
6.4.3 Lösliche und unlösliche Proteine
6.4.4 Periplasma-Gewinnung
6.4.5 Einschlusskörper-Reinigung
6.5 Proteinreinigung (Affinitätschromatographie)
6.5.1 Ni-NTA-Säule mit Stufenelution (pGP ST2)
6.5.2 Ni-NTA-Säule mit linearer Elution (pCR NT/T7)
6.5.3 9E10-Säule mit einfacher Elution (pCR NT/T7):
6.6 Proteinanalytik
6.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
6.6.2 Western-Blot
6.6.3 Coomassieblue-Färbung
6.6.4 Aktivitätsbestimmung

7. Ergebnisse und Diskussion
7.1 Sequenzierung der Triosephosphat-Isomerase
7.1.1 RNA-Präparation
7.1.2 Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
7.1.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
7.1.4 Reinigung, Minipräparation und Restriktionsanalyse
7.1.5 Sequenzierergebnis
7.1.6 Sequenzierung der DNA
7.1.7 Intronvergleich
7.1.8 5´/3´- Rapid Amplification of either 5 ´ or 3 ´ cDNA Ends -Polymerase Kettenreaktion
7.1.8.1 5´ RACE-PCR
7.1.8.2 5´ Nested-PCR
7.1.8.3 3´-RACE-PCR
7.2 Vektorenauswahl und Konstruktion der Inserts
7.2.1 Konstruktion des Inserts für den pGP-S100-Vektor
7.2.2 Konstruktion des Inserts für den pGP-ST2-Vektor
7.2.3 Konstruktion des Inserts für den pCR-NT/T7-Vektor
7.3 Expression in verschiedenen Systemen
7.3.1 Expression in XL1 E.coli Zellen mit dem pGP-S100-Vektor
7.3.2 Expression in XL-1 E.coli Zellen mit dem pGP-ST2-Vektor
7.3.3 Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
7.3.4 Expression in BL21(DE3) pLysS E.coli Zellen mit dem pCR-T7/NT-Vektor
7.3.5 Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
7.3.6 Affinitätschromatographie an der 9E10 Säule
7.4 Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase
7.4.1 Aktivitätsbestimmung
7.4.2 Strukturmodellierung
7.4.3 Strukturvergleich
7.5 Abschlußdiskussion

8. Literatur

1. Aufgabenstellung

- Ziel der Arbeit ist es, die Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor zu sequenzieren.
- Lokalisierung der Introns in diesem Gen.
- Konstruktion eines vollständige Proteinsequenz codierenden Gens zur Klonierung in einen Vektor.
- Expression dieses Proteins in einem ausgewählten Wirt.
- Erstellen eines Reinigungsprotokolls für das exprimierte Protein und anschließende Aktivitätsbestimmung.

2. Zusammenfassung

Die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus Insekten wurde nach einer Internet-Datenbankrecherche der geeignete Organismus Tenebrio molitor aus der Klasse der Käfer ausgewählt. Aus dessen Larve, die eine ausreichende Menge an Total-RNA aufweist, um die erfolgreiche Transkription in cDNA zu erlauben, konnte ein Teil im Geninneren befindlicher Sequenz amplifiziert und sequenziert werden. Bei der anschließenden Sequenzierung der genomischen DNA mittels spezifischer Primer, deren Sequenz-Abfolge aus der mRNA abgeleitet wurde, konnte die Position eines Introns lokalisiert und deren Basenabfolge bestimmt werden. Der Intronpositionsvergleich mit den zurzeit in Insekten bekannten Introns erbrachte eine neue Position, die nur in einer anderen noch nicht veröffentlichen TIM-Sequenz aus einem Käfer zu finden ist. Für die Sequenzierung des 5´- und des 3´-Endes wurde das RACE-PCR-System (rapid amplification of either 5 ´ or 3 ´ cDNA ends- Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Dadurch konnte das noch fehlende 5´-Ende erfolgreich sequenziert werden. Nach Vergleich mit vollständig bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Arten konnte das noch fehlende 3´ Ende auf eine Länge von 36 Basen bestimmt werden. Nach Vervollständigung der TIM-Sequenz durch Sequenzvergleiche mit bekannten TIM-Sequenzen aus Insekten und der anschließenden Herstellung eines Genkonstruktes für ein Fusionsprotein, das sowohl den Nachweis als auch die Reinigung des Proteins erlaubt, konnte ein Expressionssystem verwendet werden, mit dem zurzeit die größtmögliche Menge an nativem Protein exprimiert werden kann. Dieses Fusionsprotein konnte über eine Affinitätschromatographie mittels myc -Tag gereinigt werden. Bei der gereinigten Proteinfraktion konnte eine Enzymaktivität mittels eines gekoppelten Aktivitätstestes nachgewiesen werden.

3. Abkürzungsverzeichnis

18/7 AK Hausinterner Antikörper

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

4. Einleitung

Die heute zur Verfügung stehenden molekularbiologischen Techniken ermöglichen eine detaillierte Aufklärung von Abläufen in biologischen Systemen. Ein wesentlicher Beitrag wird durch die Sequenzierung der DNA und die Entschlüsselung der darin enthaltenden Informationen geliefert. Die sequenzielle Abfolge der Nukleotide in codierenden Regionen eines Gens bestimmt die Aminosäure-Sequenz, diese wiederum die dreidimensionale Struktur und damit die Funktion des jeweiligen Proteins. Proteine bilden die Basis aller biologischen Systeme. Zur Aufklärung biologischer Systeme gibt es verschiedene Lösungsansätze. Eine Möglichkeit ist die vollständige Sequenzierung der genomischen DNA einzelner Organismen. Drosophila melanogaster war eines der ersten mehrzelligen Lebewesen, dessen Genom vollständig sequenziert und entschlüsselt wurde. Ein wesentlich größeres Vorhaben ist das Human Genom Projekt, bei dem erst kürzlich die genomische DNA des Menschen praktisch vollständig sequenziert wurde. Die Zuordnung und Interpretation solcher DNA-Sequenzen ist weit aufwendiger als die eigentliche Sequenzierung. Es entstehen Datenmengen im Megabasenbereich, deren Analyse und Annotierung nur noch automatisiert erfolgen kann. Dabei werden Sequenzvergleiche mittels Datenbanksuche durchgeführt. Eine andere Möglichkeit zur Klärung der Funktion eines Proteins bietet die Sequenzierung einzelner Proteine und spezieller codierender Bereiche auf der Ebene der DNA. Abhängig davon, ob das zu untersuchende Protein bekannt ist oder ob es sich um ein neues, unbekanntes Protein handelt, kann der experimentelle Aufwand sehr unterschiedlich sein. Als eine Möglichkeit lassen sich bei bereits bekannten, verwandten Proteinen durch Vergleich der codierenden Nukleotidsequenzen dieser Proteine Primer erstellen, die eine Amplifizierung der das unbekannte Protein codierenden Nukleotidsequenz mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht.

Für die Sequenzierung und Charakterisierung in dieser Diplomarbeit wurde ein Protein ausgewählt, das besondere Kriterien erfüllt. Es sollte ein “kleines“ Protein sein, also aus nur einer Domäne bestehen, die üblicherweise zwischen 100 bis 200 Aminosäure-Reste besitzt. Innerhalb des Organismus, aus dem die codierende Sequenz für das zu untersuchende Protein gewonnen wird, muss gewährleistet sein, dass dieses Protein keine multiplen Allele aufweist, ansonsten würde diese Tatsache zu unterschiedlichen Ergebnissen bei der Sequenzierung führen. Daher ist es sehr hilfreich, wenn die proteincodierende Sequenz auf den Chromosomen homozygotisch vorkommt. Das ausgewählte Protein, die Triosephosphat Isomerase (TIM), hat neben den bereits erwähnten, vorteilhaften Charakteristika, zusätzliche interessante Aspekte, die eine Sequenzierung nahe legen. TIM kommt ubiquitär vor und ist demnach in allen Pro- und Eucaryoten zu finden. Sie ist ein Schlüsselenzym des Glycolyse Stoffwechselweges und darüber hinaus in Pflanzen am Calvin-Zyklus beteiligt.

4.1 Rolle der TIM im Stoffwechsel

Die Glycolyse, in deren Abfolge die Triosephosphat-Isomerase an fünfter Position vorkommt, ist ein Abbauweg der Glucose bei aerob und anaerob lebenden Organismen (Abb.1). In aeroben Organismen geht die Glycolyse dem Citrat-Zyklus und der Atmungskette voraus. Sie ist ein wesentlicher Bestandteil des Energiestoffwechsels. Unter aeroben Bedingungen tritt das Endprodukt Pyruvat in die Mitochondrien über und wird dort vollständig zu CO2 und H2O oxidiert. Unter anaeroben Bedingungen wird es in Ethanol oder Lactat umgewandelt. Der Glycolyse-Weg wird auch als Embden-Meyerhof-Parnas-Weg oder als Fructose-diphosphat Weg bezeichnet. In einer Folge von zehn Reaktionsschritten wird dabei Glucose zu Pyruvat abgebaut. Die Gesamtreaktion der Glycolyse ist exergon und liefert eine Energie von zwei Mol ATP pro Mol Glucose.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Darstellung der Verbindung des Glycolyse-Weges mit dem Lipidstoffwechsel. Mit roten Pfeilen ist der mögliche gekoppelte Aktivitätstest beschrieben.

TIM beschleunigt in der Glycolyse die Gleichgewichtseinstellung zwischen der Keto- und Aldotriose. Zu 96% liegt die Ketoform, d.h. Dihydroxyacetonphosphat vor. Das für die weiteren Reaktionen der Glycolyse benötigte und in geringerer Menge vorliegende Glycerinaldehyd-3-Phosphat wird durch TIM schnell nachgeliefert. Bei der Umwandlung von Dihydroxyacetonphosphat zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat katalysiert TIM eine intra molekulare Redoxreaktion, bei der ein Wasserstoffatom vom C-1 zum C-2 übertragen wird. Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) muss aber nicht ausschließlich zu Pyruvat metabolisiert werden. Im Fettsäurestoffwechsel können aus DHAP oder Glycerin-3-Phosphat mit Fettsäure Acyl-CoA-Estern Triacylglycerine synthetisiert werden, die dem Körper als Reservestoff dienen. Dieser Stoffwechselweg über Glycerin-3-Phosphat lässt sich als ein möglicher gekoppelter Aktivitätsbestimmungstest der TIM verwenden. Bei der Umwandlung von DHAP in Glycerin-3-Phosphat über Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase, wird NADH zu NAD+ verbraucht. Dieser Abbau von NADH lässt sich photometrisch bei 340 nm verfolgen. Der Ablauf des beschriebenen Aktivitätstestes wurde mit roten Pfeilen in Abbildung 1 markiert.

4.2 Regulation der Glycolyse

Die Glycolyse unterliegt wie jeder andere Stoffwechselweg Regulationen, die es erlauben, die Konzentration von Produkten innerhalb oder am Ende eines Zyklus schnell oder langsam zu beeinflussen. Man unterscheidet vier Regulationsmechanismen: allosterische Kontrolle, kovalente Modifikation, Substratzyklen und die Kontrolle auf Ebene der Transkription, wobei die Regulation der Transkription nur langsam auf sich verändernde Bedingungen reagiert. Die anderen Regulationsmechanismen können auf Stoffwechselablenkungen innerhalb von Bruchteilen von Sekunden bis Minuten reagieren. Jede enzymatische Kettenreaktion ist von der Geschwindigkeit des langsamsten Reaktionsschrittes abhängig; dies sind häufig Nichtgleichgewichtsreaktionen. In der Glycolyse kommen dafür Reaktionen in Frage, die durch Hexokinase, Phosphofructokinase (PFK) und Pyruvatkinase katalysiert werden. Die TIM ist demzufolge kein typisch regulatorisches Enzym.

4.3 Triosephosphat-Isomerase in Insekten

Neben der Glycolyse besitzt die Triosephosphat-Isomerase eine weitere wichtige Aufgabe in Insekten. Im α-Glycerophosphat Zyklus wird aus DHAP die Energie für das Fliegen gewonnen¹³. Die Aktivität von Lactat-Dehydrogenase ist selbst nach langen Flugperioden kaum in den Flugmuskeln zu messen. Dafür ist eine besonders hohe Aktivität an Glycerin-3 Phosphat-Dehydrogenase (G3P-DH) zu messen. Werden Heuschrecken für 90 Sek. in einer N2-Atmosphäre gehalten, steigt die Konzentration von Glycerin-3-Phosphat und Pyruvat um das 15- bis 20-fache an, verglichen mit einer Kontrolle. Die Endprodukte des anaeroben Kohlenhydrat-Stoffwechsel sind demnach Pyruvat und Glycerin-3-Phosphat, wie in der Abbildung 2 dargestellt ist. G3P-DH übernimmt dabei die Funktion der Reoxidation des aus der Glycolyse generierten NADH²⁸. Nach dem Transport durch die cytosolisch mitochondriale Barriere wird Glycerin-3-Phosphat über die mitochondriale Atmungskette durch Flavinmonophosphat (FMP) oxidiert und anschließend in das Cytosol zurück geführt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: α-Glycerophosphat-Weg bei Insektenmuskeln.

4.4 Struktur der Triosephosphat-Isomerase

TIM ist namensgebend für eine bestimmte Faltungsklasse das sogenannte “TIM Barrel“, da dieses symmetrische Faltungsmuster zuerst in TIM entdeckt wurde. Es ist Grundgerüst für 10% aller bekannten Enzyme, die in der Natur vorkommen²². TIM selbst ist ein Enzym, das als Dimer und Tetramer vorkommt und aus identischen Untereinheiten besteht. Andere Enzyme mit diesem Faltungsmuster besitzen unterschiedlich viele Domänen. α-Amylase, sowie Pyruvatkinase besitzen jeweils drei Domänen, wobei die katalytische Aktivität an die TIM-Barrel-Domäne geknüpft ist. TIM selber besteht nur aus einer Domäne. Das Grundgerüst ähnelt einem Fass und besteht aus acht parallelen β-Strängen, die mit acht Helices verbunden sind. Die Innenseite dieses Fasses wird von den β-Faltblättern ausgekleidet. Die α-Helices befinden sich hingegen auf der Außenseite des Barrels. ². In der Abbildung 3 wird die beschriebene Struktur von TIM dargestellt.

4.4.1 Aktives Zentrum

Das aktive Zentrum von TIM ist in allen Organismen am C-Terminus lokalisiert. Die enzymatische Aktivität der TIM ist unabhängig von Cofaktoren und Metallionen. Wie in Abbildung 3 dargestellt, sind drei Reste (Lys 12, His 94 und Glu 164), sowie eine flexible

Schleife am aktiven Zentrum beteiligt. Die am aktiven Zentrum beteiligten Reste können in der Position um 1 bis 2 Aminosäuren von Art zu Art variieren. Die Schleife besteht aus den Resten 168-174. Sie fungiert als Deckel, hält das Substrat am aktiven Zentrum und schirmt den Übergangszustand (Endiol) ab, um Seitenreaktionen mit H2O zu verhindern ³.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: TIM-Monomer aus dem Huhn. Die am aktiven Zentrum beteiligten Aminosäuren sind rot. Die α-Helices grün und β-Faltblatter blau dargestellt.

Für die Darstellung der Struktur in der Abbildung 3, wurde eine von den elf bekannten Strukturen willkürlich ausgewählt. Zurzeit ist keine TIM-Struktur aus Insekten bekannt. In Abbildung 4 leitet den ersten Schritt der katalytischen Reaktion die Abgabe eines Wasserstoffs vom C2 Atom des DHAP an die deprotonierte Carboxylgruppe der Glutaminsäure 165 ein. Dabei klappt die Doppelbindung der Keto-Gruppe um, und der Sauerstoff wird negativ geladen. Im zweiten Schritt wird ein Proton vom Histidin 95 auf den C2-Sauerstoff des DHAP übertragen. Dabei entsteht zwischen dem C1- und C2-Atom eine Doppelbindung (Enolform). Durch die negative Ladung am deprotonierten Histidin 95 wird anschließend ein Proton der Hydroxy-Gruppe des C1-Atoms auf den Imidazolring übertragen, wodurch das C2-Atom eine negative Ladung erhält. Im letzten Schritt bildet sich durch die Rückübertragung des Protons von Glutaminsäure 165 auf das C1-Atom eine Ketogruppe aus und das Reaktionsprodukt Glycerinaldehyd-3-Phosphat entsteht.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: TIM-katalysierter Reaktionsmechanismus.

aus:www.chem.uwec.edu/Webpapers_F99/Pages/Webpapers_F99/woodsrl/index.html

TIM hat einen Grad an katalytischer Perfektion erreicht, bei dem die Geschwindigkeit der Assoziation des Substrates an das Enzym diffusionskontrolliert ist. Eine weitere Steigerung der katalytischen Aktivität ist demnach nicht mehr möglich. Damit ist TIM ein “perfektes“ Enzym. Es gehört nach dem international verbindlichen System der Klassifizierungsnummern zu der 5. Hauptgruppe von Enzymen, den Isomerasen, mit der Untergruppe 3, den intramolekularen Oxidoreduktasen. Die vollständige EC-Nr. für die Triosephosphat Isomerase lautet 5.3.1.1.

4.5 TIM-Genomorganisation (Introns und Exons)

Ein Gen wird in proteincodierende (Exons) und in nicht proteincodierende Sequenzen (Introns) unterteilt. Nach dem Kopieren der DNA in pre-mRNA wird durch Prozessieren im Kern die reife mRNA gebildet. Abschließend kann die Translation der mRNA in eine Polypeptidkette am Ribosom erfolgen. Die Bedeutung von Introns ist ungeklärt. Sie sind in Prokaryonten-Genen selten zu finden. In Eukaryonten hingegen können Introns bis zu 80% eines typischen Struktur-Gens ausmachen. 1977 wurden zum ersten Mal herausschneidbare Introns entdeckt⁶. Aus dieser Entdeckung heraus bildeten sich zwei verschiedene, noch heute kontrovers diskutierte Theorien.

4.5.1 Frühe-Intron-Theorie

Die Frühe-Intron-Theorie (introns-early theory) oder auch Exon-Theorie genannt, postuliert die Gegenwart von vielen Introns in den frühen Vorfahren allen Lebens, gefolgt von massivem, meist vollständigem Verlust der Introns im Laufe der Zeit. Die ersten Gene sollen durch eine Ansammlung von Exons entstanden sein, die mittels Rekombination über Intronsequenzen verknüpft wurden. Das Resultat dieser Exonverschiebung ist nach dieser Theorie die Entstehung von vielen oder allen Introns. Desweiteren sollen die Introns als Unterstützung zur Bildung von Proteinen aus kurzen Exons, die 15 bis 20 Aminosäuren kodieren, fungieren [9-11]. Ein großer Teil des Beweises für die Frühe-Intron-Theorie stammt aus der ersten eukaryotischen TIM Sequenzierung [1-3]. Dabei stellte sich ein Zusammenhang zwischen der Sekundärstruktur und den Exons heraus. Die Orte der sechs Introns innerhalb des Huhn-Gens liegen nahe dem Ende einer α-Helix- oder einer β Faltblattstruktur¹².

4.5.2 Späte-Intron-Theorie

Bei der Späten-Intron-Theorie (introns-late-theory) geht man davon aus, dass in den ge meinsamen Vorfahren allen Lebens Introns nicht vorkommen, es also im Laufe der Evolution zu keiner Verteilung der Introns kommen konnte. Mit der Entdeckung von insgesamt sieben Introns aus Coprinus cinereus, der zu den Basidomyceten gehört, und Caenorhabditis elegans aus der Gruppe der Nematoden, stellte sich heraus, dass diese Daten unvereinbar mit der Frühen-Intron-Theorie waren⁴. Alle Introns fallen nicht mit einer Sekundärstruktur zusammen und deshalb können diese Introns keine Rolle bei der Bildung von Proteinen spielen.

Durch den rapiden Anstieg verfügbarer DNA Sequenzen, der sich ca. alle fünf Jahre um den Faktor zehn erhöht, ist es möglich statistische Aussagen über das Intronspektrum zu machen²⁵. Durch Statistik wurde festgestellt, dass keine der beiden Theorien vollständig richtig ist. Nach dem neuesten Stand enthalten beide Theorien einen wahren Kern, dabei wird das Leseraster mit einbezogen. Eine Nukleotidsequenz kann in drei Leserastern gelesen werden. Man unterscheidet die Phasen 0, 1 und 2. In einem der letzten Artikel zu dem Thema der Intron/Exon-Theorie wurde festgestellt, dass nur bei Phase 0 Introns mit der Sekundärstruktur von alten Proteinen zusammenfallen. Zu alten Proteinen zählen z.B. Acetyl-CoA Dehydrogenase, Aldolase, Cytochrom c, TIM u.v.m.. Demnach sind Introns, die sich in einer anderen Phase befinden, über die Zeit entstanden. 35% der heutigen Introns befinden sich in Phase 0. Die restlichen 65% sind durch inter- und intragenische Translokation entstanden²⁵.

4.6 Sequenzierungsmöglichkeiten

Um die Primärstruktur - also die Abfolge der Aminosäuresequenz eines zu untersuchenden Proteins - zu erhalten, gibt es verschiedene Möglichkeiten. Wählt man mRNA als Ziel der Sequenzierung aus, um die vollständige Information der Proteinsequenz zu erhalten, ist abhängig von dem Organismus auf verschiedene Dinge zu achten. Die mRNA enthält die bereits fertig gespleißte Information für die Translation in ein Protein. Eine Sequenzierung nach dem Umschreiben in cDNA und anschließender Kopierung durch die PCR ist direkt möglich. Erleichtert wird die Sequenzierung durch einen bereits bekannten Sequenzabschnitt, die 3´ Poly (A)-Sequenz. Zu beachten ist aber, dass die mRNA in Eukaryonten mono cistronisch ist, in Prokaryonten dagegen polycistronisch. Demzufolge bietet sich mRNA Sequenzierung vor allem bei Eukaryonten an. Dabei schließt sich eine Sequenzierung der DNA meist an, da die meisten Eukaryonten-Gene mit Introns durchsetzt sind. Erst jetzt wird die Information über das zu untersuchende Protein vervollständigt.

4.7 Rekombinante Expression

Rekombinante DNA-Techniken erleichtern die Untersuchung der Struktur und der Funktion von Genen erheblich. Durch homologe Rekombination kann eingeschleuste DNA in ein Zellchromosom eingebaut werden. Diese integrative Transformation findet allerdings nur mit geringer Häufigkeit statt. Eine Transformation kann effizienter durch die Einschleusung eines Plasmids erfolgen. Dabei handelt es sich um selbstständig replizierende DNA-Einheiten, die sich stabil nur in Bakterien und wenigen eukaryotischen Mikroorganismen replizieren. Die besten und vielseitigsten Vektor-Systeme stehen für E.coli zur Verfügung. Vektoren müssen verschiedene Elemente für eine Expression aufweisen: einen Replikationsursprung, Klonierungsstellen, Restriktionsorte, sowie Gene, die eine Selektion möglich machen - wie Antibiotika-Resistenzgene - und vor allem einen wirtsspezifischen Promotor. E.coli ist nicht der einzige mögliche Wirt. Unter Eukaryoten eignet sich die Hefe besonders gut. Für die Expression eukaryotischer Gene kann die Hefe gegenüber dem Bakterium E.coli von Vorteil sein. Viele eukaryotische Proteine werden nach ihrer normalen Translation durch Enzyme modifiziert, die es in Bakterien nicht gibt. Deshalb fehlen ihnen nach der Produktion in Bakterien häufig Modifikationen, die für ihre Funktion von Bedeutung sind. Das proteincodierende Gen, welches durch Ligation mit dem Vektor verschmolzen wird, weist oft zusätzliche Merkmale auf, die eine spätere Selektion erleichtern. Dabei kann es sich um das Prinzip der sogenannten Affinitätstag-Technik handeln. Diese beruht auf der Verknüpfung des gesuchten Gens mit einem leicht zu erkennenden Gen das als Tag (Etikett) bezeichnet wird. Diese kurzen Abfolgen umfassen meist 6 bis 12 Aminosäuren. Häufig werden z.B. His-Tags verwendet, bei denen es sich um sechs aufeinander folgende Histidine handelt. Mittels einer Affinitätschromatographie werden die zu isolierenden Proteine beim Durchlauf durch die Säule in hochspezifischer Weise über den Tag an einen Liganden gebunden. Die Elution erfolgt auf unterschiedliche Weise durch Veränderung des pH-Wertes, Puffer mit hoher Salzkonzentration oder durch Austausch der gebundenen Substanz gegen stärker bindende Gegenliganden. Als Liganden eignen sich niedermolekulare und hochmolekulare Verbindungen. Zu dem kann durch Verknüpfung des Gens mit einem für eine Signalsequenz codierenden Bereich, der vor dem Gen liegt, ein Bestimmungsort für die Expression festgelegt werden. Abhängig davon ob das Protein Disulfidbrücken besitzt oder nicht, kann es sogar für die richtige Faltung nötig sein, dass das Protein durch eine Signalsequenz in das Periplasma von E.coli transportiert wird, da dort erst Disulfidbrücken gebildet werden. Ein Transport ins Periplasma kann aber auch für die Reinigung des Protein von Vorteil sein. Das Periplasma kann durch spezielle Reinigungsschritte isoliert werden, wodurch anschließend weniger Proteine abgetrennt werden müssen. Bei Proteinen, die toxisch für den Wirt sind, kann eine Abgabe ins Medium von Vorteil sein, wenn dieses sich aus dem Medium leicht gewinnen lässt.

4.8 Wahl des Organismus

Die Wahl des Organismus, aus dem das zu charakterisierende Protein sequenziert werden soll, wurde nach den bereits vorhandenen Sequenzen entschieden. Nur wenig Sequenzdaten existieren von den Insekten im Gegensatz zu Prokaryonten und Wirbeltieren. Sie sind die weitaus grösste Klasse des gesamten Tierreiches mit mehr als einer dreiviertelmillion Arten. Bisher sind sie in 29 Ordnungen mit mehr als 750 Familien unterteilt. Die Ordnung der Schmetterlinge (Lepidoptera) ist in mehr als 120.000 Arten unterteilt, Hautflügler (Hymenoptera) ebenfalls mit mehr als 120.000, Zweiflügler (Diptera) mit mehr als 150.000 und die grösste Ordnung unter den Insekten bilden die Käfer (Coleoptera) mit mehr als 300.000 benamten Arten.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Zusammenstellung von Insekten (Hexapoda) - TIM-Sequenzen aus fünf der grössten Internet-

Datenbanken (Entrez Nuc, EMBL, SWISS, Trembl und SWALL), Stand Okt.01.

Bl : Zahl der Basen

AA : Länge der Polypeptidkette

+ : vollständige Sequenz

- : unvollständige Sequenz

Bei der Zuordnung vorhandenen Sequenzen von TIM in Tabelle 1 zeigt sich ein Ungleichgewicht der ausgewählten Arten gegenüber der vorhandenen Vielfalt an Arten der einzelnen Ordnungen von Insekten. Bisher wurden 18 verschiedenen TIM-Sequenzen aus der Klasse der Insekten sequenziert. Von den 18 bisher sequenzierten Arten gehören 14 zu den Zweiflüglern und vier zu den Schmetterlingen. Käfer und Hautflügler wurden nicht sequenziert. Der daraufhin ausgewählte Organismus T. molitor gehört zu der Ordnung der Käfer mit der Unterordnung Polyphaga, die aus 130 Familien besteht²⁷. T. molitor entstammen der Familie der Tenebrionidae, der Schwarzkäfer oder auch Dunkelkäfer, von denen in Mitteleuropa 50 verschiedene Arten bekannt sind. Über die ganze Erde sind annähernd 18.000 Arten verbreitet. T. molitor ist in Form der Larve auch unter dem Namen Mehlwurm bekannt. Sie ist gelbbraun und leicht zu züchten.

5. Material

5.1 Geräte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.2 Fein- und Biochemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.3 Verbrauchsmaterialien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.4 Puffer

5.4.1 Standardpuffer

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.4.2 Puffer für Agarosegelelektrophorese

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

5.4.3 Puffer für die Aktivitätsbestimmung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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