Die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus Insekten wurde nach einer Internet-Datenbankrecherche der geeignete Organismus Tenebrio molitor aus der Klasse der Käfer ausgewählt. Aus dessen Larve, die eine ausreichende Menge an Total-RNA aufweist, um die erfolgreiche Transkription in cDNA zu erlauben, konnte ein Teil im Geninneren befindlicher Sequenz amplifiziert und sequenziert werden. Bei der anschließenden Sequenzierung der genomischen DNA mittels spezifischer Primer, deren Sequenz-Abfolge aus der mRNA abgeleitet wurde, konnte die Position eines Introns lokalisiert und deren Basenabfolge bestimmt werden. Der Intronpositionsvergleich mit den zurzeit in Insekten bekannten Introns erbrachte eine neue Position, die nur in einer anderen noch nicht veroffentlichen TIM-Sequenz aus einem Kafer zu finden ist. Fur die Sequenzierung des 5´- und des 3´-Endes wurde das RACE-PCR-System (rapid amplification of either 5´ or 3´ cDNA ends-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Dadurch konnte das noch fehlende 5´-Ende erfolgreich sequenziert werden. Nach Vergleich mit vollständig bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Arten konnte das noch fehlende 3´ Ende auf eine Lange von 36 Basen bestimmt werden. Nach Vervollständigung der TIM-Sequenz durch Sequenzvergleiche mit bekannten TIM-Sequenzen aus Insekten und der anschließenden Herstellung eines Genkonstruktes fur ein Fusionsprotein, das sowohl den Nachweis als auch die Reinigung des Proteins erlaubt, konnte ein Expressionssystem verwendet werden, mit dem zurzeit die größtmögliche Menge an nativem Protein exprimiert werden kann. Dieses Fusionsprotein konnte über eine Affinitätschromatographie mittels myc-Tag gereinigt werden. Bei der gereinigten Proteinfraktion konnte eine Enzymaktivität mittels eines gekoppelten Aktivitätstestes nachgewiesen werden.
Inhaltsverzeichnis
- Aufgabenstellung
- Zusammenfassung
- Abkürzungsverzeichnis
- Einleitung
- Rolle der TIM im Stoffwechsel
- Regulation der Glycolyse
- Triosephosphat-Isomerase in Insekten
- Struktur der Triosephosphat-Isomerase
- Aktives Zentrum
- TIM-Genomorganisation (Introns und Exons)
- Frühe-Intron-Theorie
- Späte-Intron-Theorie
- Sequenzierungsmöglichkeiten
- Rekombinante Expression
- Wahl des Organismus
- Material
- Geräte
- Fein- und Biochemikalien
- Verbrauchsmaterialien
- Puffer
- Standardpuffer
- Puffer für Agarosegelelektrophorese
- Puffer für die Aktivitätsbestimmung
- Puffer für Einschlusskörper-Reinigung
- Puffer für Polyacrylamidgelelektrophorese
- Puffer für Affinitätschromatographie
- Ni-NTA-Säule
- 9E10-Säule
- Kits
- Primer
- Vektoren
- Proteine
- Stämme
- Marker
- Präparat
- Medien
- Software
- Methoden
- Nukleinsäure-Analytik
- RNA-Präparation
- cDNA-Synthese
- cDNA-Amplifikation
- Gelelektrophorese
- PCR-Reinigung
- Amplifikation der TIM-Sequenz
- DNA-Präparation und Sequenzierung
- RACE-PCR
- Konstruktion, Transformation und Expression
- PGP-S100 Vektor
- Ligation und Transformation
- Expression
- PGP-ST2 Vektor
- Ligation und Transformation
- Expression
- PCR T7/NT Vektor
- Konstruktion und Reinigung des Inserts
- Ligation und Transformation
- Expression
- PGP-S100 Vektor
- Zellaufschluss
- French Press
- Ultraschall
- Aktivitätsbestimmung
- Proteinfraktionierung
- Probenvorbereitung
- Totallysat
- Lösliche und unlösliche Proteine
- Periplasma-Gewinnung
- Einschlusskörper-Reinigung
- Proteinreinigung (Affinitätschromatographie)
- Ni-NTA-Säule mit Stufenelution (pGP ST2)
- Ni-NTA-Säule mit linearer Elution (pCR NT/T7)
- 9E10-Säule mit einfacher Elution (pCR NT/T7)
- Proteinanalytik
- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- Western-Blot
- Coomassieblue-Färbung
- Nukleinsäure-Analytik
- Ergebnisse und Diskussion
- RNA-Präparation
- Sequenzierung der Triosephosphat-Isomerase
- Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Reinigung, Minipräparation und Restriktionsanalyse
- Sequenzierergebnis
- Sequenzierung der DNA
- Intronvergleich
- 5/3'-Rapid Amplification of either 5' or 3' cDNA Ends-Polymerase Kettenreaktion
- 5' RACE-PCR
- 5' Nested-PCR
- 3'-RACE-PCR
- Vektorenauswahl und Konstruktion der Inserts
- Konstruktion des Inserts für den PGP-S100-Vektor
- Konstruktion des Inserts für den pGP-ST2-Vektor
- Konstruktion des Inserts für den pCR-NT/T7-Vektor
- Expression in verschiedenen Systemen
- Expression in XL1 E.coli Zellen mit dem pGP-S100-Vektor
- Expression in XL-1 E.coli Zellen mit dem pGP-ST2-Vektor
- Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
- Expression in BL21(DE3) pLysS E.coli Zellen mit dem pCR-T7/NT-Vektor
- Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
- Affinitätschromatographie an der 9E10 Säule
- Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase
- Aktivitätsbestimmung
- Strukturmodellierung
- Strukturvergleich
- Abschlußdiskussion
- Literatur
- Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor
- Lokalisierung von Introns im TIM-Gen
- Rekombinante Expression des TIM-Proteins
- Reinigung und Aktivitätsbestimmung des rekombinanten TIM-Proteins
- Vergleich der TIM-Sequenz mit bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Organismen
- Kapitel 1: Aufgabenstellung: Dieses Kapitel definiert die Ziele der Arbeit, darunter die Sequenzierung der TIM aus Tenebrio molitor, die Lokalisierung von Introns im Gen und die rekombinante Expression des Proteins.
- Kapitel 2: Zusammenfassung: Bietet eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse der Arbeit.
- Kapitel 3: Abkürzungsverzeichnis: Erläutert die Abkürzungen, die im Text verwendet werden.
- Kapitel 4: Einleitung: Gibt einen Überblick über die Rolle der TIM im Stoffwechsel, die Regulation der Glycolyse, die TIM in Insekten und die Struktur der TIM. Es werden außerdem die frühen und späten Intron-Theorien sowie verschiedene Möglichkeiten zur Sequenzierung und rekombinanten Expression diskutiert.
- Kapitel 5: Material: Beschreibt die Geräte, Fein- und Biochemikalien, Verbrauchsmaterialien, Puffer, Kits, Primer, Vektoren, Proteine, Stämme, Marker, Präparate, Medien und Software, die in der Arbeit verwendet wurden.
- Kapitel 6: Methoden: Detaillierte Beschreibung der Methoden, die in der Arbeit angewendet wurden, einschließlich Nukleinsäure-Analytik, Konstruktion, Transformation und Expression, Zellaufschluss, Aktivitätsbestimmung, Proteinfraktionierung und Proteinreinigung.
- Kapitel 7: Ergebnisse und Diskussion: Präsentiert die Ergebnisse der Arbeit, darunter die Sequenzierung der TIM, die Konstruktion von Expressionsvektoren, die Expression des Proteins in verschiedenen Systemen, die Reinigung des Proteins und die Charakterisierung seiner Aktivität.
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus dem Mehlkäfer Tenebrio molitor. Ziel ist es, die Introns im Gen zu lokalisieren, ein vollständiges Protein codierendes Gen zu konstruieren und dieses anschließend in einem Vektor zu klonieren. Darüber hinaus soll das exprimierte Protein gereinigt und seine Aktivität bestimmt werden.
Zusammenfassung der Kapitel
Schlüsselwörter
Triosephosphat-Isomerase, Tenebrio molitor, Sequenzierung, Klonierung, rekombinante Expression, Introns, Proteinreinigung, Aktivitätsbestimmung, Strukturmodellierung.
- Citation du texte
- Daniel Knobeloch (Auteur), 2002, Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor (Mehlwurm), Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/6779
