Die Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus Insekten wurde nach einer Internet-Datenbankrecherche der geeignete Organismus Tenebrio molitor aus der Klasse der Käfer ausgewählt. Aus dessen Larve, die eine ausreichende Menge an Total-RNA aufweist, um die erfolgreiche Transkription in cDNA zu erlauben, konnte ein Teil im Geninneren befindlicher Sequenz amplifiziert und sequenziert werden. Bei der anschließenden Sequenzierung der genomischen DNA mittels spezifischer Primer, deren Sequenz-Abfolge aus der mRNA abgeleitet wurde, konnte die Position eines Introns lokalisiert und deren Basenabfolge bestimmt werden. Der Intronpositionsvergleich mit den zurzeit in Insekten bekannten Introns erbrachte eine neue Position, die nur in einer anderen noch nicht veroffentlichen TIM-Sequenz aus einem Kafer zu finden ist. Fur die Sequenzierung des 5´- und des 3´-Endes wurde das RACE-PCR-System (rapid amplification of either 5´ or 3´ cDNA ends-Polymerase-Kettenreaktion) verwendet. Dadurch konnte das noch fehlende 5´-Ende erfolgreich sequenziert werden. Nach Vergleich mit vollständig bekannten TIM-Sequenzen aus anderen Arten konnte das noch fehlende 3´ Ende auf eine Lange von 36 Basen bestimmt werden. Nach Vervollständigung der TIM-Sequenz durch Sequenzvergleiche mit bekannten TIM-Sequenzen aus Insekten und der anschließenden Herstellung eines Genkonstruktes fur ein Fusionsprotein, das sowohl den Nachweis als auch die Reinigung des Proteins erlaubt, konnte ein Expressionssystem verwendet werden, mit dem zurzeit die größtmögliche Menge an nativem Protein exprimiert werden kann. Dieses Fusionsprotein konnte über eine Affinitätschromatographie mittels myc-Tag gereinigt werden. Bei der gereinigten Proteinfraktion konnte eine Enzymaktivität mittels eines gekoppelten Aktivitätstestes nachgewiesen werden.
Inhaltsverzeichnis
1. Aufgabenstellung
2. Zusammenfassung
4. Einleitung
4.1 Rolle der TIM im Stoffwechsel
4.2 Regulation der Glycolyse
4.3 Triosephosphat-Isomerase in Insekten
4.4 Struktur der Triosephosphat-Isomerase
4.4.1 Aktives Zentrum
4.5 TIM-Genomorganisation (Introns und Exons)
4.5.1 Frühe-Intron-Theorie
4.5.2 Späte-Intron-Theorie
4.6 Sequenzierungsmöglichkeiten
4.7 Rekombinante Expression
4.8 Wahl des Organismus
5. Material
5.1 Geräte
5.2 Fein- und Biochemikalien
5.3 Verbrauchsmaterialien
5.4 Puffer
5.4.1 Standardpuffer
5.4.2 Puffer für Agarosegelelektrophorese
5.4.3 Puffer für die Aktivitätsbestimmung
5.4.4 Puffer für Einschlusskörper-Reinigung
5.4.5 Puffer für Polyacrylamidgelelektrophorese
5.4.6 Puffer für Affinitätschromatographie
5.4.6.1 Ni-NTA-Säule
5.4.6.2 9E10-Säule
5.5 Kits
5.6 Primer
5.7 Vektoren
5.8 Proteine
5.9 Stämme
5.10 Marker
5.11 Präparat
5.12 Medien
5.13 Software
6. Methoden
6.1 Nukleinsäure-Analytik
6.1.1 RNA-Präparation
6.1.2 cDNA-Synthese
6.1.3 cDNA-Amplifikation
6.1.4 Gelelektrophorese
6.1.5 PCR-Reinigung
6.1.6 Amplifikation der TIM-Sequenz
6.1.7 DNA-Präparation und Sequenzierung
6.1.8 RACE-PCR
6.2 Konstruktion, Transformation und Expression
6.2.1 pGP-S100 Vektor
6.2.1.1 Ligation und Transformation
6.2.1.2 Expression
6.2.2 pGP-ST2 Vektor
6.2.2.1 Ligation und Transformation
6.2.2.2 Expression
6.2.3 pCR T7/NT Vektor
6.2.3.1 Konstruktion und Reinigung des Inserts
6.2.3.2 Ligation und Transformation
6.2.3.3 Expression
6.3 Zellaufschluss
6.3.1 French Press
6.3.2 Ultraschall
6.4 Proteinfraktionierung
6.4.1 Probenvorbereitung
6.4.2 Totallysat
6.4.3 Lösliche und unlösliche Proteine
6.4.4 Periplasma-Gewinnung
6.4.5 Einschlusskörper-Reinigung
6.5 Proteinreinigung (Affinitätschromatographie)
6.5.1 Ni-NTA-Säule mit Stufenelution (pGP ST2)
6.5.2 Ni-NTA-Säule mit linearer Elution (pCR NT/T7)
6.5.3 9E10-Säule mit einfacher Elution (pCR NT/T7):
6.6 Proteinanalytik
6.6.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
6.6.2 Western-Blot
6.6.3 Coomassieblue-Färbung
6.6.4 Aktivitätsbestimmung
7. Ergebnisse und Diskussion
7.1 Sequenzierung der Triosephosphat-Isomerase
7.1.1 RNA-Präparation
7.1.2 Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
7.1.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
7.1.4 Reinigung, Minipräparation und Restriktionsanalyse
7.1.5 Sequenzierergebnis
7.1.6 Sequenzierung der DNA
7.1.7 Intronvergleich
7.1.8 5´/3´-Rapid Amplification of either 5´ or 3´ cDNA Ends-Polymerase Kettenreaktion
7.1.8.1 5´ RACE-PCR
7.1.8.1 5´ Nested-PCR
7.1.8.3 3´-RACE-PCR
7.2 Vektorenauswahl und Konstruktion der Inserts
7.2.1 Konstruktion des Inserts für den pGP-S100-Vektor
7.2.2 Konstruktion des Inserts für den pGP-ST2-Vektor
7.2.3 Konstruktion des Inserts für den pCR-NT/T7-Vektor
7.3 Expression in verschiedenen Systemen
7.3.1 Expression in XL1 E.coli Zellen mit dem pGP-S100-Vektor
7.3.2 Expression in XL-1 E.coli Zellen mit dem pGP-ST2-Vektor
7.3.3 Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
7.3.4 Expression in BL21(DE3) pLysS E.coli Zellen mit dem pCR-T7/NT-Vektor
7.3.5 Affinitätschromatographie an der Ni-NTA-Säule
7.3.6 Affinitätschromatographie an der 9E10 Säule
7.4 Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase
7.4.1 Aktivitätsbestimmung
7.4.2 Strukturmodellierung
7.4.3 Strukturvergleich
7.5 Abschlußdiskussion
Zielsetzung und Themen der Arbeit
Die Diplomarbeit hat das primäre Ziel, die Triosephosphat-Isomerase (TIM) aus dem Käfer Tenebrio molitor zu sequenzieren, die Positionierung etwaiger Introns zu lokalisieren und das Gen für eine rekombinante Expression in einen geeigneten Wirtsorganismus zu klonieren. Im Zuge der Arbeit soll zudem ein Reinigungsprotokoll für das exprimierte Protein entwickelt und dessen enzymatische Aktivität mittels biochemischer Testverfahren charakterisiert werden.
- Sequenzierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor
- Analyse und Lokalisierung von Intron-Positionen im TIM-Gen
- Konstruktion und Optimierung von Expressionsvektoren für das Protein
- Durchführung und Vergleich der rekombinanten Proteinexpression in E. coli
- Reinigung mittels Affinitätschromatographie und enzymatische Aktivitätsbestimmung
Auszug aus dem Buch
4.4 Struktur der Triosephosphat-Isomerase
TIM ist namensgebend für eine bestimmte Faltungsklasse das sogenannte “TIM Barrel“, da dieses symmetrische Faltungsmuster zuerst in TIM entdeckt wurde. Es ist Grundgerüst für 10% aller bekannten Enzyme, die in der Natur vorkommen [22]. TIM selbst ist ein Enzym, das als Dimer und Tetramer vorkommt und aus identischen Untereinheiten besteht. Andere Enzyme mit diesem Faltungsmuster besitzen unterschiedlich viele Domänen. α-Amylase, sowie Pyruvatkinase besitzen jeweils drei Domänen, wobei die katalytische Aktivität an die TIM-Barrel-Domäne geknüpft ist. TIM selber besteht nur aus einer Domäne. Das Grundgerüst ähnelt einem Fass und besteht aus acht parallelen β-Strängen, die mit acht Helices verbunden sind. Die Innenseite dieses Fasses wird von den β-Faltblättern ausgekleidet. Die α-Helices befinden sich hingegen auf der Außenseite des Barrels.[2]. In der Abbildung 3 wird die beschriebene Struktur von TIM dargestellt.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Aufgabenstellung: Zusammenfassung der primären Forschungsziele, einschließlich der Sequenzierung, Klonierung und Charakterisierung der TIM aus Tenebrio molitor.
2. Zusammenfassung: Ein kurzer Überblick über den gewählten Organismus, die methodische Vorgehensweise bei der Sequenzierung mittels RACE-PCR und die erfolgreiche Charakterisierung des exprimierten Proteins.
4. Einleitung: Erläuterung der Bedeutung der TIM im Stoffwechsel, insbesondere der Glycolyse, und die theoretische Auseinandersetzung mit der Genomorganisation sowie den verschiedenen Intron-Theorien.
5. Material: Auflistung der verwendeten Laborgeräte, Chemikalien, Puffer-Zusammensetzungen, Enzyme, Vektoren und Softwaretools für die molekularbiologische Arbeit.
6. Methoden: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Arbeitsschritte, von der RNA-Präparation über die cDNA-Synthese und PCR-Analytik bis hin zur Proteinreinigung und Western-Blot-Analytik.
7. Ergebnisse und Diskussion: Ausführliche Darlegung und Interpretation der gewonnenen Sequenzdaten, phylogenetische Einordnung, Optimierung der Expressionssysteme und Auswertung der Charakterisierungsergebnisse.
Schlüsselwörter
Triosephosphat-Isomerase, Tenebrio molitor, Genomorganisation, Intron, Exon, RACE-PCR, rekombinante Expression, Affinitätschromatographie, Enzymkinetik, Glycolyse, Strukturmodellierung, Proteinexpression, E. coli, Klonierung, Sequenzierung
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Diplomarbeit?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der molekularbiologischen Sequenzierung und funktionellen Charakterisierung des Enzyms Triosephosphat-Isomerase aus dem Käfer Tenebrio molitor.
Welche zentralen Themenfelder werden abgedeckt?
Die Themen umfassen die Genetik, insbesondere die Genomorganisation und Intron-Analyse, sowie die praktische Biotechnologie durch rekombinante Proteinproduktion in bakteriellen Systemen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel ist die vollständige Sequenzierung des Gens, die Konstruktion eines Expressionsvektors und die Etablierung eines Reinigungsprotokolls, um das Protein isolieren und seine Aktivität prüfen zu können.
Welche Methoden finden Anwendung?
Es werden klassische molekularbiologische Techniken wie RT-PCR, RACE-PCR zur Sequenzierung, sowie die Affinitätschromatographie zur Reinigung und der Western-Blot zum Nachweis von Fusionsproteinen eingesetzt.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Im Hauptteil liegt der Fokus auf der methodischen Durchführung der Gen-Identifizierung, den Klonierungsstrategien für verschiedene Vektorsysteme sowie der Diskussion der Ergebnisse der Proteinexpression und Charakterisierung.
Welche Keywords beschreiben die Arbeit am besten?
Wichtige Begriffe sind Triosephosphat-Isomerase, Tenebrio molitor, rekombinante Expression, Affinitätschromatographie und RACE-PCR.
Warum wurde Tenebrio molitor als Modellorganismus gewählt?
Der Käfer wurde nach einer Datenbankrecherche gewählt, da er ausreichend RNA-Mengen in seinen Larven aufweist und als Vertreter der Käfer eine bisher unsequenzierte Gruppe für dieses Enzym repräsentiert.
Was ergab die Analyse der Introns?
Es konnte ein Intron in der Sequenz lokalisiert werden, welches phylogenetisch als "Recent"-Intron eingestuft wurde, was eine neue Position in der bekannten TIM-Struktur darstellt.
- Quote paper
- Daniel Knobeloch (Author), 2002, Sequenzierung und Charakterisierung der Triosephosphat-Isomerase aus Tenebrio molitor (Mehlwurm), Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/6779
