Vergleichende morphologische und molekularbiologische Untersuchungen der Artdifferenzierung innerhalb der Gattung Littorina

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Einführung in die Biologie der Littorinidae
1.2 Artdifferenzierung innerhalb der Gattung Littorina
1.3 Molekularbiologische Untersuchungen zur Phylogenie
1.4 Zielsetzung
1.5 Das Untersuchungsgebiet

2 Material und Methoden
2.1 Lösungen, Substanzen und Geräte
2.2 Gehäuse und Weichkörper
2.3 Terminologie
2.4 Transport und Haltung lebender L. obtusata und L. fabalis
2.5 Beobachtungs- und Meßmethoden
2.6 Dokumentationsmethoden
2.7 Molekularbiologische Methoden
2.7.1 Präparation des Gewebes und DNA Extraktion
2.7.2 RAPD (random amplified polymorphic DNA)
2.7.3 Gelelektrophorese

3 Ergebnisse
3.1 Einführung in die Ergebnisse
3.2 Morphologische Untersuchungen an L. obtusata und L. fabalis
3.2.1 Größenverteilung
3.2.2 Gehäusemorphologie
3.2.3 Penismorphologie
3.2.4 Radula
3.2.5 Gelege von L. obtusata und L. fabalis
3.2.6 Morphologie einer gelben Variation von L. fabalis
3.3 Ökologische Befunde
3.3.1 Nahrungspräferenzen
3.3.2 Horizontale und vertikale Verbreitung
3.4 Molekularbiologische Befunde

4 Diskussion
4.1 Einführung in die Diskussion
4.2 Diskussion der morphologischen Merkmale
4.2.1 Gehäusemorphologie
4.2.2 Größenverteilung und Populationsdynamik
4.2.3 Penismorphologie
4.2.4 Radula
4.2.5 Gelege
4.2.6 Polymorphismen
4.2.6.1 Variationen von L. obtusata
4.2.6.2 Variationen von L. fabalis
4.3 Bewertung der ökologischen Befunde
4.4 Diskussion der molekularbiologischen Befunde
4.5 Zusammenfassung und Ausblick

Farbtafeln und Arealkarten
Tafel 1: Gehäusemorphologie
Tafel 2: Penismorphologie
Tafel 3: Radulae
Tafel 4: L. fabalis (gelb)
Tafel 5: Detailkarten der Areale
Tafel 6: PCR-Bandenmuster

Anhang A Lösungen, Substanzen und Geräte

Anhang B Messergebnisse

Anhang C Schlüssel für die Freilandbestimmung

Literaturverzeichnis

Danksagung

Kapitel 1

Einleitung

1.1 Einführung in die Biologie der Littorinidae

Die Littorinidae (Strandschnecken) repräsentieren eine Familie der Littorinoidea, die ihrerseits als Überfamilie den Mesogastropoda zugeordnet werden.

Die Gehäuse der Littorinidae sind oft fest und dickwandig, meist ungenabelt und zeichnen sich durch eine rundliche bis hochkreiselförmige Gestalt aus. Die Gehäusemündung ist rund bis eiförmig und kann durch ein conchinöses, pauci- oder multispirales Operculum verschlossen werden. Der flache, abgerundete Kopf der Tiere trägt zwei Fühler, an deren Basis die Augen ein weinig erhaben liegen. Der Fuß ist durch eine Längsfurche unterteilt und somit zu ditaxischer Bewegung befähigt. Oft sind die monopectinaten Kiemen reduziert und werden dann funktionell durch die blutbahnreiche Wand der Mantelhöhle ersetzt. Littorinidae sind getrenntgeschlechtliche Tiere mit mäßigem Sexualdimorphismus. Der vom Mantel gebildete Abschnitt der ausleitenden Genitalwege (pallialer Gonodukt) ist bei den männlichen Tieren eine offene Rinne, bei den weiblichen Tieren jedoch ein geschlossener Gang, der meist in einen Ovipositor führt. Nach einer inneren Befruchtung werden Eier gelegt, die sich über planktische Veliger weiterentwickeln. Bei einigen Arten kann jedoch auch das Fehlen eines Larvenstadiums beobachtet werden.

Die Littorinidae umfassen ca. 100 Arten, die in 17 Gattungen aufgeteilt werden und weltweite Verbreitung erlangt haben. Besonders in tropischen Regionen erreichen die Tiere bisweilen unglaubliche Besiedlungsdichten. Mit Ausnahme von Cremnoconchus (Blanford, 1869), der an süßwasserberieselten Felsen Vorderindiens vorkommt, sind alle Littorinidae marin oder leben amphibisch in der Gezeitenzone. Die Gattung Littorina stellt mit ca. 80 Arten die zahlenmäßig größte Gruppe der Littorinidae dar.

Der Lebensraum der meisten Strandschnecken ist, wie der Familienname Littorinidae schon vermuten läßt, das Litoral. Eine Präferenz haben die Tiere für Felsküsten mit Algenbewuchs, an welchem sie ihre Eikapseln befestigen können. Littorinidae zeigen eine beachtliche Toleranz gegenüber den Lebensbedingungen im Gezeitenbereich, so daß sie auch längere Perioden des Trockenfalls überstehen können. Diese Fähigkeit sichert ihnen häufig eine dominante Stellung auf feuchtem oder halbaquatischem Territorium. Einige Arten dringen bis in die nur selten überflutete „Kampfzone“ des Supralitorals vor, wo sie nur geringfügiger Konkurrenz mit anderen Mollusken ausgesetzt sind.

1.2 Artdifferenzierung innerhalb der Gattung Littorina

Zwei Vertreter der Gattung Littorina stehen im Mittelpunkt der folgenden Untersuchungen: die flachen Strandschnecken Littorina obtusata (Linnaeus, 1758) und Littorina fabalis (Turton, 1825).

Diese beiden gehäusemorphologisch schwer zu unterscheidenden Arten wurden erst 1966 von Sacchi & Rastelli unter dem Synonym L. mariae ^[1] voneinander getrennt. Für die erstbeschriebene Art Littorina obtusata, die nach Colman (1932) als Synonym für Littorina littoralis angesehen wird, erkannten bereits Dautzenberg & Fischer (1915) deutliche Variabilitäten in der Größe der Gehäuse. Daher schlugen die Autoren die Bezeichnung „minima nov. var.“ vor für die kleineren Vertreter oder „Zwergformen“ der Stichproben von Kérity in der Nähe von Paimpol (Côtes-du-Nord). Von denselben Autoren ist das Vorkommen einer „Zwergform“ von L. obtusata bei Roscoff (Bretagne) belegt worden (Dautzenberg & Fischer, 1925).

Eine biometrische Untersuchung von Colman (1932) an Populationen von L. obtusata in Plymouth Sound (England) erbrachte zwar auch hier das Vorhandensein der „Zwergform“, jedoch keine systematische Abgrenzung von der übrigen Population. Das Auftreten zweier, durch Gehäusegrößen definierter Morphe wurde hier auf die Koexistenz unterschiedlicher Altersgruppen zurückgeführt. Neben den Untersuchungen zur Gehäusemorphologie wurden nun verstärkt auch anatomische Merkmale in die Untersuchungen einbezogen, wie zum Beispiel in der Monographie über britische Prosobranchiaten von Fretter & Graham (1962, 1994). Untersuchungen am Weichkörper von L. obtusata und L. fabalis zeigten einen deutlichen Unterschied im Aufbau des Penis (Sacchi & Rastelli, 1966). Während der in Ruhe befindliche Penis bei L. obtusata ein kurzes distales Ende besitzt und die Penisdrüsen in 2 bis 3 Reihen angeordnet sind, bildet der Penis bei L. fabalis ein langes distales Ende und nur eine Reihe Penisdrüsen aus. Auch die juvenilen L. obtusata, bei welchen die Penisdrüsen in nur einer oder zwei Reihen angeordnet sind und im Laufe der weiteren Entwicklung progressiv durch weitere Reihen ergänzt werden (Linke, 1933, 1934), lassen sich anhand der verschiedenartigen Gestaltung und Größe der Penisdrüsen ab einem gewissen Entwicklungsstadium von den juvenilen L. fabalis unterscheiden.

Neben den Unterscheidungscharakteristiken in der Größe der Gehäuse und der Struktur des Penis erkannte Sacchi (1969a), daß es Unterschiede in der Lebensweise und der Ökologie von L. obtusata und L. fabalis gibt. Beide Arten sind Bewohner des Eulitorals. Dieser Bereich ist durch den regelmäßigen Wechsel von Trockenfallen und Wasserbedeckung geprägt. Der mechanische Einfluß durch Wellenschlag sowie starke Temperaturschwankungen stellen wichtige limitierende Faktoren dar. In diesem Bereich siedelt sich L. fabalis etwas tiefer an als L. obtusata und dringt dabei sogar bis ins obere Sublitoral vor, wo sie oft auf den Ledertangen Fucus vesiculosus und Fucus serratus zu finden ist. L. obtusata hingegen bevorzugt das mittlere und obere Eulitoral und entfaltet hier ihre größte Bevölkerungsdichte auf Fucus spiralis und Ascophyllum nodosum. Damit geht ein Unterschied in der Toleranz gegenüber Austrocknung einher, wie aus Laborexperimenten deutlich wurde. L. fabalis reagiert wesentlich empfindlicher auf Trockenfallen als L. obtusata. Der Toleranzbereich gegenüber Trockenheit und Temperaturschwankungen variiert jedoch zwischen Populationen unterschiedlicher geographischer Gebiete mit verschiedenem Tidenhub (Sacchi, 1969a).

1.3 Molekularbiologische Untersuchungen zur Phylogenie

Um die Stammesgeschichte der Gattung Littorina besser verstehen zu können, wurden in jüngerer Zeit molekularbiologische Untersuchungen auf Grundlage der vorhandenen morphologischen und kladistischen Studien (Reid, 1989, 1990) durchgeführt. Ward konnte 1990 Ergebnisse zur Untersuchung der Signifikanz von Variationen in der Allozymausstattung verschiedener Littorinen vorlegen. Zur Untersuchung der Allozym-Muster bedient man sich meist der Stärke-Gel-Elektrophorese (Southern, 1975). Man erhält so charakteristische Bandenmuster der Enzyme einzelner Tiere und kann Aussagen über die Frequenz der Allozyme in einer Population machen. Besteht zwischen zwei Populationen intensiver Austausch, so unterscheiden sich die Allozymfrequenzen zwischen diesen Populationen nicht. Findet jedoch kein Austausch statt oder ist dieser stark eingeschränkt, so unterscheiden sich die Frequenzen, und man kann aus der Größe der Unterschiede auf die Dauer der Trennung und die Zahl der Tiere schließen, die pro Generationsfolge zuwandern. Hierbei kommt es in manchen Fällen zur Ausbildung von habitatspezifischen Variationen und zur Unterbrechung des Genflusses innerhalb einer Art in einem eng umgrenzten geographischen Gebiet (Johannesson & Tatarenkov, 1997). Das Auftreten solcher Variabilitäten konnte für die rauhe Strandschnecke (Littorina saxatilis) unter Zuhilfenahme der Allozymaustattung für die schwedische Westküste belegt werden.

In anderen Analysen konnten Wilding, Mill & Grahame (1999) bei Sequenzierungen eines 8 kb langen Fragments mitochondrialer DNA von L. saxatilis nicht nur zeigen, daß das Fragment die kompletten Gene für 12 t-RNAs und fünf Proteine kodiert, sondern auch, daß die mitochondriale DNA innerhalb der Gastropoden wenig konservativ ist und sich somit für Untersuchungen evolutiv junger Prozesse eignet. Diese Tatsache machten sich bereits Rumback & Reid (1994) bei der Erstellung eines umfangreichen molekularen Stammbaums der Littorinen zunutze. Teile des 12S rRNA Gens dienten als Grundlage der Untersuchungen an 11 Littorina und zwei Nodilittorina Arten. Die Ergebnisse unterstützten weitgehend das von Reid (1990) erstellte morphologische Kladogramm.

Eine weitere Methode zur Untersuchung der Abstammung einzelner Arten und zur systematischen Einordnung von nahe verwandten Spezies, die eine Alternative zur Sequenzierung amplifizierter Gene darstellt, ist die in den letzten Jahren etablierte RAPD (R andomly A mplified P olymorphic D NA). RAPD basiert auf der Herstellung und dem Vergleich eines genetischen Fingerabdrucks, der durch Extraktion und Amplifikation genomischer DNA mit zufällig gewählten kurzen Nukleotid-Primern (10-20 bp) synthetisiert wird. Vergleiche zwischen Populationen von L. obtusata, L. fabalis und L. saxatilis nach dem RAPD Prinzip wurden für Island und die schwedische Westküste angestellt (Mikhailova & Johannesson, 1998).

1.4 Zielsetzung

Sowohl morphologische, ökologische als auch molekularbiologische Unterschiede zwischen Populationen der Strandschnecken L. obtusata und L. fabalis auf der Nordseeinsel Helgoland sollen im Folgenden näher untersucht werden. Dabei liegt das Augenmerk zum einen auf der morphologischen und genetischen Unterscheidbarkeit von L. fabalis und L. obtusata und zum anderen auf der Untersuchung morphologisch differenzierbarer Populationen von L. fabalis, die innerhalb eines sehr kleinen Areals koexistieren.

1.5 Das Untersuchungsgebiet

Als Untersuchungsgebiet wurde die deutsche Insel Helgoland gewählt. Helgoland ist die einzige Felseninsel in der südlichen Nordsee. Helgoland liegt nördlich des 54. Breitengrads nördlicher Breite und westlich des 8. Längengrads östlicher Länge. Die Entstehung der Insel, die Abfolge der Gesteinsschichten und die Einflüsse durch Witterung, Gezeiten und durch den Menschen sind u. a. von Hillmer et al. (1979), Krumbein (1975, 1977), Pratje (1948), Schmidt-Thomé (1937) und Wurster (1962) ausführlich beschrieben worden. Im Norden, Westen und Süden ist die heutige Insel von einer Abrasionsterasse umgeben, deren obere Schichten von der See abgetragen worden sind. Ein Teil dieses Sockels fällt in Abhängigkeit von den Gezeiten periodisch trocken. Dieser wird auf Helgoland als „Felswatt“ bezeichnet. In den Jahren 1903 bis 1942 wurde entlang der Westseite eine ca. 6 m hohe Schutzmauer errichtet, die in ihrer letzten Bauphase bis weit über die Nordspitze hinaus verlängert wurde (Krumbein, 1975). Sie teilt die Abrasionsterasse in das Westwatt und das Nordostwatt. Nur das Felswatt im Nordosten gibt heute noch einen annähernd authentischen Eindruck der ursprünglichen Verhältnisse am Felsfuß wieder. Es befindet sich im Wellenschatten der Nordwestmole.

Im Untersuchungsgebiet beträgt die mittlere Tidendauer 12,4 h bei einem durchschnittlichen Tidenhub von 2,2 m. Bei Hochwasser reicht der Wasserstand im Nordostwatt bis an die steile Klippenwand und überspült gerade noch die dort siedelnden Grünalgenbestände. Bei Niedrigwasser fällt ein großer Teil der Abrasionsterasse bis zu 300 m seewärts frei. Man kann in Anlehnung an Lewis (1964) und Stephenson & Stephenson (1949, 1972) den Lebensraum Küste in drei vertikale Zonen unterteilen: (1) Das Supralitoral (Spritzwasserzone) wird nur bei extremen Springtiden und Sturmfluten überspült. Diese Zone bildet den Übergang zum terrestrischen Lebensraum. (2) Das Eulitoral (Gezeitenzone im engeren Sinne) liegt zwischen der mittleren Tidenniedrigwasserlinie (MTNWL) und der mittleren Tidenhochwasserlinie (MTHWL). Hier entwickelt sich im Gegensatz zum Supralitoral eine reichhaltige Algenbesiedlung, die sich zumeist horizontal zonieren läßt. Lewis (1964) unterteilt diese Zone in ein oberes, mittleres und unteres Eulitoral. Die typische Algenbesiedlung im oberen Eulitoral besteht aus Enteromorpha spp., Blidingia spp., Porphyra spp. und Pelvetia canaliculata. Pelvetia fehlt jedoch auf Helgoland. Im mittleren und unteren Eulitoral wachsen als Leitformen Fucus spp. und Ascophyllum nodosum. Auch Ascophyllum nodosum fehlt auf Helgoland als bestandsbildende Art. Diese Braunalge besiedelt jedoch einige geschützt gelegene Molenabschnitte. (3) Das Sublitoral (Dauerflutzone) ist der Bereich unterhalb der MTNWL. Nur der oberste Saum fällt bei extremen Springtiden trocken. Die typische Algenbesiedlung wird durch Laminaria -Arten repräsentiert. Die vorliegende Untersuchung beschränkt sich auf das Eulitoral und den obersten Bereich des Sublitorals. Dies ist der Lebensraum von L. obtusata und L. fabalis.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Kapitel 2

2 Material und Methoden

2.1 Lösungen, Substanzen und Geräte

Alle verwendeten Lösungen, Substanzen und Geräte sind im Anhang A aufgelistet.

2.2 Gehäuse und Weichkörper

Um der Wertschätzung der untersuchten Tiere zu genügen, werden diese im Folgenden nicht als Tiermaterial, sondern in terminologisch korrekter Weise schlicht als Tiere (Gehäuse und Weichkörper) geführt.

Gehäuse, lebende und konservierte Tiere von L. obtusata und L. fabalis standen von vier ausgewählten Fundorten (Arealen) auf der Nordseeinsel Helgoland zur Verfügung (Abb. 2.1). Detailkarten der Areale sind auf Tafel 5 dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2.1: Schematisierte Karte der Insel Helgoland. Die Fundorte sind mit Areal A, Areal B, Areal C und Areal D gekennzeichnet

Die geographische Position der Areale wurde mittels GPS auf 4 m genau bestimmt. Von April bis Juli 2002 wurden Tiere sowohl von Mitarbeitern der Biologischen Anstalt Helgoland als auch vom Verfasser gesammelt und teilweise fixiert. Beim Sammeln wurde aus Naturschutzgründen auf das Umdrehen von Steinen verzichtet, um die Störung im Lebensraum für andere dort lebende Organismen möglichst gering zu halten. Da L. obtusata und L. fabalis vorwiegend auf Ledertangen der Gattung Fucus leben, wurden diese vorsichtig und sorgfältig nach den Tieren abgesucht.

Lebende Tiere und Gelege wurden sowohl im Freiland als auch in einer Aquarienanlage in Giessen untersucht. Gehäusemorphologische, biometrische und anatomische Studien konnten im Labor der Biologischen Anstalt auf Helgoland und an der Universität Giessen durchgeführt werden. Tiere, deren Anatomie untersucht werden sollte, wurden in 7,5 % MgCl2-Lsg. narkotisiert (Reid, 1996) und dann in eine Mischung aus gleichen Teilen von 70 %igem Ethanol und Glycerin überführt (Götting, 2002, pers. Mitteilung). Das anschließende Entschalen der Tiere erfolgte entweder durch 10 % HCl oder durch eine Weiterentwicklung der von Linke (1933) eingeführten Technik mittels eines handelsüblichen Obtusataknackers™.

2.3 Terminologie

Die in dieser Arbeit verwendete Terminologie für Gehäuse und Weichkörper der Littorinen geht auf Reid (1996) zurück.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2.2: Terminologie des Gehäuses einer repräsentativen Littorina spec.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2.3: Schema eines männlichen Tieres von Littorina sp. (nach Reid, 1996)

Abkürzungen: cm, Ansatzstelle des Columellarmuskels am Gehäuse; f, Penisfilament; hg, Hypobran-chialdrüse; m, Mantelrand; mpg, Penisdrüsen; op, Operculum; p, Prostatadrüse; r, Rectum; s, Magen; sb, glatte Region der Penisbasis; sv, Seminalvesikel; t, Hoden; wb, faltige Region der Penisbasis

2.4 Transport und Haltung lebender L. obtusata und L. fabalis

Der Transport lebender Exemplare erfolgte in verschiedenen PVC-Behältern mit 1 bis 5 Litern Fassungsvermögen. Auf gut angefeuchteten Ledertangen (F. spiralis, F. vesiculosus) ließen sich die Tiere über mehr als 48 Stunden am Leben erhalten. Die Überlebensrate lag bei ca. 90 % gegenüber 5 % bei einem Transport in frischem Seewasser, da dieses durch die Ausscheidungen der Tiere binnen weniger Stunden vergiftet wurde (Baensch, 1986; Lorenz, 2000; diese Studie).

Zur längerfristigen Haltung von L. obtusata und L. fabalis eigneten sich Aquarien mit einem Fassungsvermögen von 70 bis 100 Litern. Zur Vergrößerung des Wasserkörpers und somit zur Stabilisierung des Systems wurden 3 Aquarien miteinander verbunden. Das gesamte Wasservolumen von 230 Litern wurde mit einer Pumpe der Marke Eheim™ in einem Kreislauf bewegt. Die Salinität wurde variabel innerhalb einer Dichte von 1,019 - 1,023 gehalten, zur Überprüfung dienten handelsübliche Aräometer. Die Regulation der Salinität erfolgte durch Zugabe von Süßwasser oder von aufgelöstem Meersalz der Firma Tropic Marin®. Von einem regelmäßigen Wasserwechsel konnte durch die Verwendung eines Eiweißabschäumers abgesehen werden. Der im Aquarium entstehende Algenbewuchs diente den Bewohnern als regenerative Nahrungsquelle, die für eine Besiedlung von 30 Tieren pro Becken ausreichte. Aufgrund des weiten Temperatur-Toleranzbereichs der Littorinen (Sacchi, 1966, 1969) war eine Haltung bei Raumtemperatur möglich.

2.5 Beobachtungs- und Meßmethoden

Bei der vergleichenden Bearbeitung verschiedener Populationen von L. fabalis wurde großen Wert darauf gelegt, daß die Untersuchungen nur an sympatrischen Exemplaren durchgeführt wurden. Da ökologische Faktoren den Phänotyp stark beeinflussen können (Reimchen, 1981, 1982 und 1989; Ekendahl, 1994, 1995; Lejhall, 1998), muß für morphologische Vergleiche eine Durchmischung von Exemplaren verschiedener Standorte unbedingt vermieden werden (Gallardo & Götting, 1985; Lorenz & Hubert, 1993). Dieser Anspruch setzte voraus, daß zur Aufsammlung nur begrenzte, im Profil und Bewuchs identische, zusammenhängende Bereiche ausgewählt wurden. Dies hatte jedoch zur Folge, daß nur wenige Exemplare pro Fundort zur Verfügung standen. Das Aufsammeln einer statistisch auswertbaren Anzahl von Tieren hätte auf einem nur wenige Quadratmeter umfassenden Gebiet eine starke Störung der Population bedeutet. Von eingehender statistischer Bearbeitung der vorhandenen Proben wurde daher abgesehen.

Messungen am Gehäuse wurden, wie von Reid (1996) vorgeschlagen, durchgeführt. Gehäusegrößen wurden mit einer Schieblehre der Firma Helios™ auf 1/10 Millimeter genau bestimmt. Messungen anatomischer Strukturen, zum Beispiel am Penis von L. obtusata und L. fabalis, wurden unter einem Binokular der Firma Wild™ mittels eines geeichten Maßstabes vorgenommen.

2.6 Dokumentationsmethoden

Von allen anatomisch untersuchten Tieren wurden digitale Bilder des Gehäuses und des Penis mit einer Nikon™ Coolpix 990 aufgenommen und auf einem IBM™ PC und einem Apple Macintosh™ bearbeitet. Die Aufnahmen des Penis und der Penisdrüsen von L. obtusata und L. fabalis erfolgten unter Verwendung eines eigens zu diesem Zweck konstruierten Aufsatzes für die Digitalkamera (Schmand, pers. Design), der auf den Tubus des Binokulars aufgesetzt werden konnte.

Von Radula Präparaten wurden sowohl lichtmikroskopische als auch raster-elektronenmikroskopische Bilder erstellt. Für die Lichtmikroskopie wurde ein Olympus™ BX 51 mit Differential-Interferenzkontrast verwendet. Die Radulazähnchen wurden in KOH gekocht und nach fünfminütiger Goldbedampfung an einem Philips LX 20™ Rasterelektronenmikroskop untersucht.

2.7 Molekularbiologische Methoden

Zur Darstellung der genetischen Unterschiede zwischen L. obtusata und L. fabalis und innerhalb der L. fabalis Population wurden DNA Fragmente mittels zufällig gewählter kurzer Primer (RAPD -Technik) während einer PCR amplifiziert und anschließend in einem Gel aufgetrennt. Hierzu war zunächst die Extraktion genomischer DNA aus Tiergewebe erforderlich.

2.7.1 Präparation des Gewebes und DNA Extraktion

Die DNA Extraktion erfolgte nach dem Protokoll des E.Z.N.A.® Invertebrate DNA Kit der Firma Peqlab™. Für das Entfernen der in den Proben meist reichlich vorhandenen Polysacchariden bedient sich das Kit einer Extraktion mit Cetyltrimethyl-ammoniumbromid (CTAB) und Chloroform. In Verbindung mit HiBind®-DNA-Zentrifugensäulen konnte auf diese Weise genomische DNA von hoher Qualität gewonnen werden.

Die molekularbiologischen Analysen wurden sowohl mit frisch getöteten Tieren als auch mit Alkoholmaterial durchgeführt. Lebende Tiere wurden langsam auf 5 °C herabgekühlt, entschalt und anschließend in flüssigem Stickstoff eingefroren. Für die Extraktion genomischer DNA wurden ca. 30 mg Tiergewebe aus der Fußmuskulatur der Schnecken verwendet. Es wurden nur Tiere ausgewählt, deren Kriechsohlen keine durch Trematoden hervorgerufene Verfärbungen zeigten (Werding, 1969), um eine Kontamination der Probe mit artfremder DNA zu vermeiden. Das Gewebe wurde in allen Fällen sofort nach dem Ausschneiden in flüssigem Stickstoff eingefroren und in einem Mörser pulverisiert. Etwa 20-30 mg Pulver wurden nacheinander mit 350 ml Homogenisationspuffer und 25 ml Proteinase K (20 mg/ml) in Lösung gebracht. Bei einigen Proben war eine 30minütige Inkubation bei 60 °C nötig, um das Gewebepulver vollständig in Lösung zu bringen. Nach dem Lysieren der Probe wurde zur Polysaccharidentfernung 350 ml Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) zugegeben und mit einem Reagenzglasschüttler gemischt. Nach 2minütigem Zentrifugieren bei 10.000 x g wurde die obere wäßrige Phase vorsichtig in ein frisches Zentrifugenröhrchen überführt, ohne dabei die milchig-trübe Interphase zu verletzen. Das alte Zentrifugenröhrchen mit der organischen Phase und der Interphase wurde verworfen. Durch Zugabe von 0,7 Volumen Isopropanol wurde die DNA präzipitiert. Die Probe wurde nun bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubiert und danach für 10 Minuten bei 10.000 x g zentrifugiert, um die präzipitierte DNA zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 300 ml sterilem, deionisiertem MilliQ-Wasser resuspendiert, mit 20 ml RNase A (20 mg/ml) versetzt und gemischt. Nacheinander wurden 200 ml ML2-Puffer und 300 ml absolutes Ethanol zugegeben und durch Vortexen gemischt. Der gesamte Ansatz wurde auf eine HiBind®-Zentrifugensäule geladen und für 1 Minute bei 8.000 x g zentrifugiert. Der Säulendurchfluß wurde verworfen und die DNA 2mal mit 750 ml DNA-Waschpuffer gewaschen. Anschließend wurde die Zentrifugensäule durch zweiminütiges Zentrifugieren bei 10.000 x g vollständig getrocknet und die DNA mit 70 ml auf 60 bis 70 °C vorgewärmtem Elutionspuffer oder mit 10 mM Tris-Cl, pH 8,0 eluiert. Bei Bedarf konnte ein zweiter Elutionsschritt folgen. Die Konzentration der so gewonnenen genomischen DNA wurde photometrisch bestimmt und lag zwischen 54 und 175 mg/ml, mit einem Reinheitsgrad zwischen 1,5 und 2,0 (Quotient der Extiktion bei 260 und 280 nm).

2.7.2 RAPD (random amplified polymorphic DNA)

Polymorphismen lassen sich auch dann nachweisen, wenn die Basensequenz unbekannt ist. Dies gelingt mit Hilfe der RAPD-Technik (random amplified polymorphic DNA), die auch unter der Bezeichnung „willkürlich gestartete PCR“ (arbitrarily primed PCR) bekannt ist (Newton & Graham, 1994). Man kann diese Polymorphismen dann als genetische Marker oder auch zur Genkartierung einsetzen. Das Nachweisverfahren arbeitet mit kurzen Primern, die aus ungefähr zehn beliebigen Nucleotiden bestehen.

Zur Untersuchung der Polymorphismen wurde das RAPD Protokoll von Williams et al. (1990) mit Modifikationen nach Sundberg & Andersson (1995) und Mikhailova & Johannesson (1998) verwendet. Dazu wurden 1 ml extrahierter genomischer DNA (Konzentration 25 ng/ml) mit 1ml 50 mM MgCl2, 0,5 ml 10 mM dNTP Mix, 2,5 ml 10x Puffer, 1ml Primer, 18,5 ml H2O und 0,5 ml Ampli Taq® (5U/ml) amplifiziert. Die Amplifikation erfolgte in einem Gradienten-Cycler der Firma Peqlab™ innerhalb von 40 Zyklen mit einer einleitenden Denaturierung bei 94 °C für 2 Minuten. Jeder Zyklus beinhaltete die folgenden Schritte: 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 36 °C und 2 Minuten bei 72 °C. Anschließend wurden die Proben bis zur weiteren Bearbeitung auf 4 °C herabgekühlt. Für die PCR wurden zwanzig 10 bp oligonucleotid RAPD Primer (Operon Technologies, Du Pont, USA) aus dem Kit O verwendet. Diese Primer besitzen eine willkürliche Sequenz, wobei der Anteil von Cytosin und Guanin zwischen 60 und 70 % variiert.

2.7.3 Gelelektrophorese

Auf ein Agarose-Gel aufgetragene DNA-Fragmente lassen sich im elektrischen Feld proportional zu ihrer Größe auftrennen. Für Fragmente zwischen 50 bp und 20 kb genügen Agarosegele zwischen 0,7 % und 2 % Agaroseanteil (Gewichtsprozent). Die Agarosegele wurden wahlweise mit 1x TAE- oder 0,5x TBE-Puffer angesetzt und in entsprechenden Laufpuffer gegeben. Nach erfolgter Auftrennung wurden die Gele in Ethidiumbromid für 20 Minuten gefärbt und anschließend für 20 Minuten zur Kontrastschärfung im Wasserbad behandelt. Die Fragmente konnten unter UV-Licht bei 312 nm sichtbar gemacht werden, da Ethidiumbromid in DNA interkaliert und fluoresziert. Um Rückschlüsse auf die Größen der jeweiligen Fragmente ziehen zu können, wurden 100 bp Molekulargewichtstandarts mitaufgetragen. Die Aufnahme der Bandenmuster erfolgte mit einer Polaroid™ Gelcam.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Kapitel 3

3 Ergebnisse

3.1 Einführung in die Ergebnisse

Die Nordseeinsel Helgoland stand schon früher im Mittelpunkt wissenschaftlicher Betrachtungen an Littorinen (Linke, 1933; Ziegelmeier, 1963, 1966; Gallardo & Götting, 1985). Hierbei handelte es sich jedoch hauptsächlich um anatomische, reproduktionsbiologische und taxonomische Studien. Das Vorkommen von L. obtusata auf Helgoland wurde bereits 1845 von Menke nachgewiesen, für L. fabalis liegt ein Nachweis von Lorenz (1998) als L. mariae (vgl. Kapitel 4) und ein Neunachweis von Götting (2001) vor. Einige morphometrische Aspekte finden in der Arbeit von Gallardo & Götting (1985) vor dem Hintergrund der Reproduktionsfähigkeit Berücksichtigung. Die Verteilung von L. obtusata und L. fabalis an verschiedenen Küstenabschnitten Helgolands sowie innerhalb eines eng umgrenzten Küstenbereichs sollte in der vorliegenden Arbeit überprüft werden. Besonderes Augenmerk lag dabei auf den morphologischen Unterschieden zwischen L. obtusata und L. fabalis. Ein Teil der Untersuchung sollte auch ökologische Aspekte berücksichtigen. Nur unzureichend bekannt war, ob sich die Resultate der vergleichenden ökologischen Untersuchungen an Littorinen, wie zum Beispiel von Sacchi (1969) an der galizischen und bretonischen Küste, auch auf Helgoland übertragen lassen. Schließlich sollten für Helgoland erstmalig auch molekularbiologische Untersuchungen an Littorinen durchgeführt werden, die eine reproduktive Isolation von Populationen belegen können.

3.2 Morphologische Untersuchungen an L. obtusata und L. fabalis

Im Zuge der morphologischen Untersuchungen wurden bei 85 Tieren genaue Messungen am Gehäuse durchgeführt. Berücksichtigt wurden Höhe (H), Breite (B), Mächtigkeit (M), äußere Aperturlänge (LA), innere Aperturlänge (LI) und Columellarweite (C). Alle Meßergebnisse finden sich im Anhang B aufgelistet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3.1: Meßgrößen am Gehäuse einer flachen Strandschnecke (nach Reid, 1996)

3.2.1 Größenverteilung

Die Gehäusegröße adulter Tiere ist ein erstes, jedoch unzureichendes Bestimmungsmerkmal zur Unterscheidung von L. obtusata und L. fabalis, da die Gehäuse von L. obtusata im Durchschnitt größer werden, als die von L. fabalis. Es gibt jedoch Überschneidungsbereiche, in welchen die Gehäuse gleiche Größen aufweisen. Die Gehäusehöhe (H) variiert bei L. obtusata zwischen 10,7 und 13,4 mm, während sie bei L. fabalis zwischen 8,3 und 12 mm liegt. Die Häufigkeit, mit der bestimmte Gehäusehöhen im Nordostwatt auftreten, ist in Abbildung 3.2 dargestellt. L. obtusata zeigt variable Breiten (B) im Bereich zwischen 11,5 und 14 ,8 mm mit einer maximalen Häufigkeit bei etwa 13,5 mm. Die Breiten liegen bei L. fabalis zwischen 8,6 und 13,4 mm. Das Häufigkeitsmaximum der Breite liegt bei etwa 10,7 mm. Die Mächtigkeit der Gehäuse fällt bei L. obtusata in einen Bereich zwischen 7,6 und 9,5 mm, und bei L. fabalis liegt diese zwischen 5,9 und 8,2 mm. Innere und äußere Aperturlänge (LI und LA) sind im Mittel bei L. obtusata größer als bei L. fabalis (vgl. Anhang B).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3.2: Relative Häufigkeit der Gehäusegrößen von L. obtusata und L. fabalis im Nordostwatt

Bei den Messungen der Columellarweite konnten keine Unterschiede zwischen L. obtusata und L. fabalis festgestellt werden. Setzt man die Columellarweite jedoch in ein Verhältnis zur Gehäusehöhe, so ist sie, in der Relation gesehen, bei L. fabalis größer als bei L. obtusata. Dies ist darauf zurückzuführen, daß L. fabalis in der Größe des Gehäuses meist hinter L. obtusata zurückbleibt. Die Größen der Operculi korrelieren mit denen der inneren Aperturlängen. Alle Meßgrößen zeigen einen Überschneidungsbereich zwischen beiden Arten. Dieser Bereich ist bei der Artbestimmung als indifferent anzusehen.

3.2.2 Gehäusemorphologie

Neben den Unterschieden in der Größe der Gehäuse existieren auch strukturelle Unterschiede im Aufbau (vgl. Abbildung 3.3). So ist bei L. fabalis der Apex völlig eingeebnet, während er bei L. obtusata eine kleine Spitze ausbildet. Die letzte Windung des Gehäuses erzeugt bei L. obtusata, von der Aperturseite betrachtet, einen Absatz mit der davorliegenden Windung (vgl. Tafel 1, I). Die Naht des letzten Umganges ist bei L. fabalis dem Apex stark genähert, so daß die Aufsicht der Aperturseite einer elliptischen Form ähnelt (vgl. Tafel 1, V). Bei etwa 20 % der untersuchten L. fabalis wurde jedoch eine ähnlich starke Erhebung des Apex wie bei L. obtusata beobachtet. Die Columellarlippe ist bei L. fabalis stärker ausgezogen und auch im Verhältnis zur Gehäusegröße insgesamt dicker als bei L. obtusata. Hierdurch wirkt die Öffnung breiter und ovaler, während sie bei L. obtusata annähernd kreisrund ist (vgl. Tafel 1, IV).

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Abb. 3.3: Unterschiede am Gehäuse von L. fabalis (links) und L. obtusata (rechts)

Auf Tafel 1 sind unterschiedliche Variationen der Gehäuse von L. obtusata und L. fabalis jeweils in dorsaler und ventraler Aufsicht dargestellt. Die Ziffern I bis IV zeigen Gehäuse von L. obtusata, die Ziffern V bis VIII Gehäuse von L. fabalis.

3.2.3 Penismorphologie

Als wichtiges Unterscheidungskriterium zwischen L. obtusata und L. fabalis gilt die anatomische Struktur des Penis. Auf Tafel 2 sind verschiedene Penistypen im nicht-erigierten Zustand abgebildet. Dabei handelt es sich bei den Ziffern I bis IV um die Begattungsorgane von L. obtusata und bei den Ziffern V bis VIII um die von L. fabalis. Der Penis von L. obtusata ist flach und in seiner Größe variabel. An seinem distalen Ende bildet er eine kurze Spitze aus, die nur geringfügig über den darunterliegenden Drüsensaum hinausragt (vgl. Tafel 2, I). Die Penisdrüsen, die nach Linke (1933) auch als „Klebdrüsen“ oder als „drüsige Papillen“ (Fretter & Graham, 1980) bezeichnet werden, liegen in 2 bis 3 Reihen an der zum Körper des Tieres gerichteten Peripherie des Penis (vgl. Tafel 2, IV). Die Anzahl der Drüsen ist variabel und kann 16-53 betragen. Im Durchschnitt findet man allerdings 20-25 Drüsen, die keine diskreten Reihen, sondern einen ineinander verschobenen Saum bilden (vgl. Abb. 3.4).

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Abb. 3.4: Aufbau des Penis von L. fabalis (links) und L. obtusata (rechts)

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^[1] L. mariae = L. fabalis, vgl. Kapitel 4.2.2.