In dieser Arbeit soll der mögliche Einfluss von CAR und PPARa auf die Regulation des Indy-Gens in Säugetierhepatozyten untersucht werden. Dazu wurden Rattenhepatozyten mit dem CAR-Aktivator Phenobarbital und dem PPARa-Agonisten WY 14643 stimuliert und anschließend die Indy mRNA, die Indy-Promotoraktivität und der 14C-Citrattransport untersucht. Die Ergebnisse und deren Konsequenzen werden in dieser Arbeit dargestellt.
Kalorische Restriktion verbessert die Gesundheit und verlängert die Lebensspanne über nahezu alle Speziesgrenzen hinweg. Hierbei kann durch Funktionsänderungen von Genen wie z.B. dem Indy („I am not dead-yet“)-Gen der Zustand kalorischer Restriktion simuliert und folglich die Lebenserwartung erhöht werden. Das in Drosophila melanogaster entdeckte Indy-Gen codiert einen Tricarboxylattransporter, der Intermediate des Citrat-Zyklus in Zellen transportiert. Diese können zur Energieversorgung des Organismus genutzt werden. Über die Regulation des Indy-Gens ist noch wenig bekannt.
In Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass die Indy-Expression in Drosophila malanogaster, Caenorabididtis elegans und Mus musculus durch Fasten reprimiert wurde. In Rattenhepatozyten dagegen wurde das Gen durch das Hungerhormon Glucagon
induziert. Im Fastenzustand werden noch weitere Gene hochreguliert, wie z.B die Transkriptionsfaktoren PPARa und CAR. Diese kontrollieren wiederum Gene des Energiestoffwechsels.
Unser Lebensstil - der Anteil an körperlicher Aktivität oder die Art und Menge der täglichen Nahrungsaufnahme - beeinflusst nicht nur das Auftreten bestimmter Erkrankungen sondern darüber hinaus unsere Lebenserwartung. Gerade das Ernährungsverhalten spielt dabei eine entscheidende Rolle. Eine den Bedarf übersteigende Nahrungsaufnahme führt langfristig zur Adipositas und erhöht das Risiko ernährungsbedingte Krankheiten wie Diabetes mellitus Typ II, Insulinresistenz, oder kardiovaskuläre Erkrankungen zu entwickeln. Dadurch sinkt die Lebenserwartung.
Dagegen ist es möglich durch eine reduzierte Kalorienzufuhr die Entstehung von Krankheiten zu vermeiden und so die Lebenserwartung zu erhöhen. Auch unabhängig von der Krankheitsvermeidung kann Kalorienrestriktion die Lebenserwartung verlängern, denn durch Verringerung der Nahrungsaufnahme wird nicht nur der Körperfettanteil reduziert sondern zudem der Alterungsprozess verlangsamt.
Inhaltsverzeichnis
- I. Einleitung
- I.1 Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit
- I.2 Das Indy-Gen und seine Funktion im Zustand kalorischer Restriktion
- I.2.1 Struktur und Funktion des Indy-Genprodukts
- I.2.2 Zusammenhang zwischen Indy-Expression und Lebenserwartung
- I.3 Die Rolle von CAR und PPAR α im Energiemetabolismus
- I.4 Ziel der Arbeit
- II. Material und Methoden
- ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
- MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
- BIOCHEMISCHE METHODEN
- III. Ergebnisse
- III.1 Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
- III.1.1 Induktion der Cyp2B1 mRNA
- III.1.2 Induktion der Indy mRNA
- III.2 Regulation der Cyp2B10 und Indy mRNA in mHC durch PB und WY14643
- III.2.1 Induktion der Cyp2B10 bei C57B/6 Mäusen
- III.2.2 Induktion der Indy mRNA bei C57B/6 Mäusen
- III.2.3 Induktion der Cyp2B10 und Indy mRNA in 129SV Mäusen
- III.3 Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergen-Konstrukten durch PB und WY14643 in Rattenhepatozyten
- III.3.1 Aktivierung des Cyp2B1-Promotors und der Indy-Promotorfragmente
- III.4 Umklonierung der rindy-Promotorfragmente in Renilla-Luciferasevektor
- III.5 Regulation der Aktivität von Indy Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 mit Renilla-Luciferase als Reportergen
- III.6 Modulation der Firefly-Luciferase mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY1463
- III.7 Regulation des 14C-Citrattransports in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
- IV. Diskussion
- IV.1 Einfluss von PB und WY 14643 auf die Cyp2B- und Indy-Expression in Ratten- und Maushepatozyten
- IV.1.1 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Cyp2B1-Expression in Rattenhepatozyten
- IV.1.2 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Indy-Expression in Rattenhepatozyten
- IV.1.3 Einfluss von PB und WY 14643 auf den Citrattransport
- IV.1.4 Vergleich der Indy- und Cyp2B-Regulation in Maus- und Rattenhepatozyten
- IV.2 Mögliche physiologische Relevanz einer Regulation von Indy durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPAR α
- IV.3 Luciferase als Reportergen bei der Untersuchung PB-abhängigen Aktivierung von Promotoren
- IV.4 Schlussfolgerung
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Ziel dieser Bachelorarbeit ist die Identifizierung von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion des Indy-Gens führen, sowie der Nachweis der funktionellen Relevanz dieser Induktion. Die Arbeit untersucht den Einfluss von Phenobarbital (PB) und WY14643, bekannten Agonisten der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα, auf die Expression von Indy und Cyp2B1 in Ratten- und Maushepatozyten.
- Regulation der Indy-Genexpression durch CAR und PPARα
- Einfluss von Phenobarbital (PB) und WY14643 auf die Indy- und Cyp2B1-Expression
- Funktionelle Relevanz der Indy-Induktion
- Vergleich der Indy-Regulation in Ratten- und Maushepatozyten
- Anwendung von Luciferase-Reportergensystemen
Zusammenfassung der Kapitel
I. Einleitung: Dieses Kapitel führt in die Thematik der kalorischen Restriktion und ihrer Auswirkungen auf die Langlebigkeit ein. Es beschreibt die molekularen Mechanismen, die diesem Phänomen zugrunde liegen, und stellt das Indy-Gen und seine Rolle im Kontext kalorischer Restriktion vor. Die Bedeutung der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα im Energiemetabolismus wird erläutert, bevor das Ziel der Arbeit definiert wird – die Untersuchung der CAR-abhängigen Induktion von Indy und die Klärung der funktionellen Bedeutung dieser Induktion.
II. Material und Methoden: Dieses Kapitel beschreibt detailliert die verwendeten zellbiologischen, molekularbiologischen und biochemischen Methoden. Es umfasst die Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten, Transfektionsmethoden, RNA-Isolierung und cDNA-Synthese, Real-Time-qPCR, Agarosegel-Elektrophorese, Klonierungsverfahren, Luciferase-Assays und die Messung des Citrattransports. Die einzelnen Schritte werden präzise und nachvollziehbar dargestellt, um die Reproduzierbarkeit der Experimente zu gewährleisten.
III. Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die Ergebnisse der durchgeführten Experimente. Es zeigt die Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA-Expression in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643, sowie deren vergleichende Analyse in verschiedenen Mauslinien. Weiterhin werden die Ergebnisse zur Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergenkonstrukten und die Auswirkungen auf den Citrattransport detailliert beschrieben. Die Daten werden übersichtlich in Tabellen und Abbildungen präsentiert.
Schlüsselwörter
Indy-Gen, kalorische Restriktion, Langlebigkeit, CAR, PPARα, Phenobarbital, WY14643, Rattenhepatozyten, Maushepatozyten, Cyp2B1, Real-Time-qPCR, Luciferase-Reportergen, Citrattransport, Genexpression, Promotoranalyse.
Häufig gestellte Fragen zur Bachelorarbeit: Regulation des Indy-Gens durch CAR und PPARα
Was ist das Thema der Bachelorarbeit?
Die Bachelorarbeit untersucht die Regulation des Indy-Gens durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα. Im Fokus steht die Identifizierung von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion des Indy-Gens führen, und der Nachweis der funktionellen Relevanz dieser Induktion.
Welche Methoden wurden in der Arbeit angewendet?
Die Arbeit verwendet eine Vielzahl von zellbiologischen, molekularbiologischen und biochemischen Methoden. Dazu gehören die Kultivierung von Ratten- und Maushepatozyten, Transfektionsmethoden, RNA-Isolierung und cDNA-Synthese, Real-Time-qPCR, Klonierungsverfahren, Luciferase-Assays und die Messung des Citrattransports. Die einzelnen Methoden werden detailliert im Kapitel "Material und Methoden" beschrieben.
Welche Substanzen wurden verwendet, um die Genexpression zu beeinflussen?
Phenobarbital (PB) und WY14643 wurden als bekannte Agonisten der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα eingesetzt, um deren Einfluss auf die Expression von Indy und Cyp2B1 zu untersuchen.
Welche Zelltypen wurden untersucht?
Die Untersuchungen wurden an Rattenhepatozyten und Maushepatozyten (C57B/6 und 129SV Mäuse) durchgeführt.
Welche Gene wurden untersucht?
Die Hauptfokusgene waren das Indy-Gen und das Cyp2B1-Gen (und Cyp2B10 in Mäusen). Die Arbeit analysiert die Regulation ihrer mRNA-Expression und die Aktivität ihrer Promotoren.
Welche Ergebnisse wurden erzielt?
Die Ergebnisse zeigen die Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA-Expression in Ratten- und Maushepatozyten durch PB und WY14643. Es wurden Unterschiede in der Regulation zwischen den verschiedenen Mauslinien beobachtet. Die Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergenkonstrukten wurde ebenfalls untersucht, ebenso wie der Einfluss auf den Citrattransport. Die detaillierten Ergebnisse sind im Kapitel "Ergebnisse" dargestellt.
Welche Schlussfolgerungen wurden gezogen?
Die Arbeit liefert Erkenntnisse zur CAR-abhängigen Induktion des Indy-Gens und deren funktioneller Relevanz. Die Ergebnisse zeigen einen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von CAR und PPARα und der Regulation von Indy und Cyp2B1. Die genaue Rolle und die physiologische Bedeutung der Indy-Induktion bedürfen weiterer Untersuchungen. Die Anwendung von Luciferase-Reportergensystemen erwies sich als nützlich zur Untersuchung der Promotoraktivität.
Welche Schlüsselwörter beschreiben die Arbeit am besten?
Indy-Gen, kalorische Restriktion, Langlebigkeit, CAR, PPARα, Phenobarbital, WY14643, Rattenhepatozyten, Maushepatozyten, Cyp2B1, Real-Time-qPCR, Luciferase-Reportergen, Citrattransport, Genexpression, Promotoranalyse.
Wo finde ich detailliertere Informationen?
Die vollständige Bachelorarbeit enthält detaillierte Informationen zu den Methoden, Ergebnissen und der Diskussion. (Hinweis: Die vollständige Arbeit ist hier nicht enthalten, sondern nur eine Zusammenfassung.)
- Arbeit zitieren
- Christine Ploschenz (Autor:in), 2011, Identifikation von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion von INDY führen. Nachweis der funktionellen Relevanz, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/981525
