In dieser Arbeit soll der mögliche Einfluss von CAR und PPARa auf die Regulation des Indy-Gens in Säugetierhepatozyten untersucht werden. Dazu wurden Rattenhepatozyten mit dem CAR-Aktivator Phenobarbital und dem PPARa-Agonisten WY 14643 stimuliert und anschließend die Indy mRNA, die Indy-Promotoraktivität und der 14C-Citrattransport untersucht. Die Ergebnisse und deren Konsequenzen werden in dieser Arbeit dargestellt.
Kalorische Restriktion verbessert die Gesundheit und verlängert die Lebensspanne über nahezu alle Speziesgrenzen hinweg. Hierbei kann durch Funktionsänderungen von Genen wie z.B. dem Indy („I am not dead-yet“)-Gen der Zustand kalorischer Restriktion simuliert und folglich die Lebenserwartung erhöht werden. Das in Drosophila melanogaster entdeckte Indy-Gen codiert einen Tricarboxylattransporter, der Intermediate des Citrat-Zyklus in Zellen transportiert. Diese können zur Energieversorgung des Organismus genutzt werden. Über die Regulation des Indy-Gens ist noch wenig bekannt.
In Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass die Indy-Expression in Drosophila malanogaster, Caenorabididtis elegans und Mus musculus durch Fasten reprimiert wurde. In Rattenhepatozyten dagegen wurde das Gen durch das Hungerhormon Glucagon
induziert. Im Fastenzustand werden noch weitere Gene hochreguliert, wie z.B die Transkriptionsfaktoren PPARa und CAR. Diese kontrollieren wiederum Gene des Energiestoffwechsels.
Unser Lebensstil - der Anteil an körperlicher Aktivität oder die Art und Menge der täglichen Nahrungsaufnahme - beeinflusst nicht nur das Auftreten bestimmter Erkrankungen sondern darüber hinaus unsere Lebenserwartung. Gerade das Ernährungsverhalten spielt dabei eine entscheidende Rolle. Eine den Bedarf übersteigende Nahrungsaufnahme führt langfristig zur Adipositas und erhöht das Risiko ernährungsbedingte Krankheiten wie Diabetes mellitus Typ II, Insulinresistenz, oder kardiovaskuläre Erkrankungen zu entwickeln. Dadurch sinkt die Lebenserwartung.
Dagegen ist es möglich durch eine reduzierte Kalorienzufuhr die Entstehung von Krankheiten zu vermeiden und so die Lebenserwartung zu erhöhen. Auch unabhängig von der Krankheitsvermeidung kann Kalorienrestriktion die Lebenserwartung verlängern, denn durch Verringerung der Nahrungsaufnahme wird nicht nur der Körperfettanteil reduziert sondern zudem der Alterungsprozess verlangsamt.
Inhaltsverzeichnis
- Inhaltsverzeichnis
- Abkürzungsverzeichnis
- Verzeichnis der Abbildungen
- Zusammenfassung
- Einleitung
- Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit
- Das Indy-Gen und seine Funktion im Zustand kalorischer Restriktion
- Struktur und Funktion des Indy-Genprodukts
- Zusammenhang zwischen Indy-Expression und Lebenserwartung
- Die Rolle von CAR und PPAR α im Energiemetabolismus
- Ziel der Arbeit
- Material und Methoden
- ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
- Isolierung und Reinigung von Hepatozyten nach Meredith
- Hepatozytenkultivierung
- Puffer und Lösungen
- Durchführung der Hepatozytenkultivierung
- Transfektion von primären Rattenhepatozyten
- Puffer und Lösungen
- Prinzip
- Transfektionscocktail
- Durchführung der Transfektion primärer Hepatozyten
- Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit Phenobarbital und WY14643
- Puffer und Lösungen
- Stimulation primärer Hepatozyten
- MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
- Isolierung von Gesamt-RNA
- Puffer und Lösungen
- RNA-Isolierung
- Synthese von cDNA-mRNA-Hybriden
- Puffer und Lösungen
- Synthese von cDNA
- Real-Time-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
- Puffer und Lösungen
- Grundprinzip der RT-qPCR
- Durchführung der RT-qPCR
- Agarosegel-Elektrophorese
- Puffer und Lösungen
- Auftrennung der DNA im Agarosegel
- Isolierung von DNA aus Agarosegel
- Umklonierung der rindy-Promotorfragmente aus pGL3-basic in den Vektor pGL4.83
- Prinzip
- Puffer und Lösungen
- Ligation der rindy-Promotorfragmente mit pGL4.83
- Transformation der pGL4.83 - rIndyprom- Plasmide in E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation
- Puffer und Lösungen
- Transformation kompetenter E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation
- Analyse rekombinanter Bakterienkolonien durch Plasmid-präparation im Mini-Maßstab
- Puffer und Lösungen
- Reinigung von Plasmid-DNA durch Affinitäts-Chromatographie im Mini-Maßstab
- Charakterisierung von Plasmid-DNA durch Restriktionsspaltung
- Puffer und Lösungen
- BIOCHEMISCHE METHODEN
- Messung der Luciferase-Reportergenaktivität
- Puffer und Lösungen
- Grundprinzip des Luciferase Assay
- Durchführung des Luciferase-Assays
- Proteinbestimmung nach Bradford
- Messung des Citrattransports in primäre Hepatozyten der Ratte
- Puffer und Lösungen
- Durchführung der Citrattransportstudie
- Ergebnisse
- Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
- Induktion der Cyp2B1 mRNA
- Induktion der Indy mRNA
- Regulation der Cyp2B10 und Indy mRNA in mHC durch PB und WY14643
- Induktion der Cyp2B10 bei C57B/6 Mäusen
- Induktion der Indy mRNA bei C57B/6 Mäusen
- Induktion der Cyp2B10 und Indy mRNA in 129SV Mäusen
- Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergen-konstrukten durch PB und WY14643 in Rattenhepatozyten
- Aktivierung des Cyp2B1-Promotors und der Indy-Promotorfragmente
- Umklonierung der rindy-Promotorfragmente in Renilla-Luciferasevektor
- Regulation der Aktivität von Indy Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 mit Renilla-Luciferase als Reportergen
- Modulation der Firefly-Luciferase mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY1463
- Regulation des 14C-Citrattransports in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
- Diskussion
- Einfluss von PB und WY 14643 auf die Cyp2B- und Indy-Expression in Ratten- und Maushepatozyten
- Wirkung von PB und WY 14643 auf die Cyp2B1-Expression in Rattenhepatozyten
- Wirkung von PB und WY 14643 auf die Indy-Expression in Rattenhepatozyten
- Einfluss von PB und WY 14643 auf den Citrattransport
- Vergleich der Indy- und Cyp2B-Regulation in Maus - und Ratten-hepatozyten
- Mögliche physiologische Relevanz einer Regulation von Indy durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPAR α
- Luciferase als Reportergen bei der Untersuchung PB-abhängigen Aktivierung von Promotoren
- Schlussfolgerung
- Literaturverzeichnis
- Anhang
- Danksagung
- Regulation des Indy-Gens durch CAR und PPARα
- Identifizierung von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion von INDY führen
- Funktionelle Relevanz der INDY-Induktion
- Einfluss von Phenobarbital (PB) und WY14643 auf die Expression von Indy und Cyp2B in Hepatozyten
- Citrattransport in Hepatozyten
- Einleitung: Dieses Kapitel führt in die molekularen Mechanismen der kalorischen Restriktion und ihrer Auswirkungen auf die Lebenserwartung ein. Es werden die Struktur und Funktion des Indy-Gens sowie dessen Zusammenhang mit der Lebenserwartung erläutert. Darüber hinaus werden die Rolle von CAR und PPARα im Energiemetabolismus und die Zielsetzung der Arbeit vorgestellt.
- Material und Methoden: Dieses Kapitel beschreibt die verwendeten Methoden und Materialien für die zellbiologischen und molekularbiologischen Experimente. Es werden die Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten, die Transfektion und Stimulation mit Phenobarbital und WY14643, die RNA-Isolierung und die Real-Time-PCR erläutert. Darüber hinaus werden die Methoden zur Plasmid-Präparation, Restriktionsspaltung und Messung der Luciferase-Aktivität beschrieben.
- Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die Ergebnisse der Experimente. Es werden die Auswirkungen von Phenobarbital und WY14643 auf die Expression von Indy und Cyp2B in Hepatozyten untersucht, sowie die Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergen-Konstrukten durch Phenobarbital und WY14643. Des Weiteren werden die Ergebnisse der Umklonierung der rindy-Promotorfragmente in Renilla-Luciferasevektor und die Modulation der Firefly-Luciferase mRNA durch Phenobarbital und WY14643 vorgestellt.
- Diskussion: Dieses Kapitel analysiert und interpretiert die Ergebnisse der Arbeit. Es wird der Einfluss von Phenobarbital und WY14643 auf die Expression von Indy und Cyp2B in Hepatozyten diskutiert, sowie die mögliche physiologische Relevanz einer Regulation von Indy durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα. Des Weiteren werden die Ergebnisse im Kontext der Literatur diskutiert.
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Bachelorarbeit befasst sich mit der Untersuchung der Regulation des Indy-Gens durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα im Kontext des Energiemetabolismus. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die molekularen Mechanismen zu identifizieren, die zu einer CAR-abhängigen Induktion von INDY führen und die funktionelle Relevanz dieser Induktion zu belegen.
Zusammenfassung der Kapitel
Schlüsselwörter
Indy-Gen, kalorische Restriktion, Langlebigkeit, CAR, PPARα, Phenobarbital, WY14643, Hepatozyten, Citrattransport, Reportergen, Real-Time-PCR, Promotor, Expression, Regulation.
- Arbeit zitieren
- Christine Ploschenz (Autor:in), 2011, Identifikation von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion von INDY führen. Nachweis der funktionellen Relevanz, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/981525
