Synthese von C-7 Derivaten der Sialinsäure

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Theoretischer Teil
2.1 Entdeckung und Struktur der Sialinsäuren
2.2 Vorkommen der Sialinsäuren
2.3 Biosynthese der Sialinsäuren und ihre biologische Bedeutung
2.4 Chemische und enzymatische Synthesen der Sialinsäuren
2.5 Organokatalyse: Prinzipien und Anwendung in der Synthese

3 Zielsetzung und Aufgabenstellung

4 Beschreibung und Diskussion der Ergebnisse
4.1 Synthesestrategie zur Darstellung der 6-epi-Sialinsäure
4.2 Versuche zur Darstellung von 6- epi -Sialinsäure
4.3 Synthesestrategie zur Darstellung des 7- O -Methylsialinsäure
4.4 Synthese zur 7- O -Methylsialinsäure
4.5 Darstellung von N-Acetylneuraminsäure und N-Acetylneuraminsäure- methylester mit Hilfe der Prolin-katalysierten Aldolreaktion

5 Zusammenfassung und Ausblick der Synthese

6 Experimenteller Teil
6.1 Allgemeines
6.2 Darstellung der Verbindungen aus Kapitel 4.2
6.3 Darstellung der Verbindungen aus Kapitel 4.4
6.4 Darstellung der Verbindungen aus Kapitel 4.5

7 Abkürzungsverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

1. Einleitung

Alle lebenden Zellen von Archaea bis Eukaryoten sind von einer Membran umgeben. Zellmembranen sind sehr komplex aufgebaut, elastisch verformbar und stellen nicht nur eine selektive Barriere gegen die Außenwelt dar, sondern erfüllen gleichzeitig unterschiedliche Aufgaben¹. Hierher gehören unter Anderem zahlreiche Stoffwechselreaktionen, aktiver Transport von unterschiedlichen chemischen Substanzen und Ionen durch die Kanäle, Energieumwandlungsreaktionen wie Photosynthese und oxidative Phosphorylierung. Außerdem enthalten sie Oberflächenrezeptoren, die vor allem für die Weiterleitung und Verstärkung der Signale verantwortlich sind.

Entsprechend der gegenwärtigen Theorie wird die Biomembran als Fließmembran-Modell dargestellt.

Laut dieser Theorie besteht die Membran aus einer doppelten Schicht Lipide und zahlreichen eingebauten Proteinen. An manche Proteine sind unterschiedliche Kohlenhydrat-reste angelagert. Diese Proteine werden als Gluko- proteine bezeichnet².

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Abb. 1: Membranschema³

Die Erkenntnisse, dass die physiologische Bedeutung der Kohlenhydrate über die bekannten Funktionen als Energiequelle (Glukose), als Energiespeicher (Glykogen) und als Gerüstsubstanzen (Zellulose) hinausgeht, setzten neue Akzente in der Biologie. Kohlenhydratanteile verleihen sowohl körpereigenen als auch körperfremden Zellen eine ausgeprägte Fähigkeit einander zu erkennen. Die Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglichen unter Anderem z.B. die Differenzierung von Zellen und Gewebetypen⁴.

Als endständige Komponente von Glucoproteinen sind häufig N -Acetylneuraminsäuren (auch Sialinsäuren genannt) zu finden.

Wegen ihrer Position werden Sialinsäuren bedeutende biologische Rollen zugeschrieben.

2. Theoretischer Teil

2.1 Entdeckung und Struktur der Sialinsäuren

Die Sialinsäuren sind sehr komplexe, natürlich vorkommende Einzelzucker mit relativ kurzer wissenschaftlicher Geschichte. 1927 erhielten Walz sowie Levene und Landsteiner den ersten Hinweis auf die Existenz der Sialinsäuren, als sie Glykolipide mit Orcin in eisenchloridhaltiger Salzsäure erhitzten und eine rotviolette Färbung beobachteten. Diese Substanz wurde erstmals von Blix im Jahre 1936 aus Rindersubmaxillarismucin, einem Glucoprotein der Unterkieferspeicheldrüse, isoliert. Wegen der Abstammung wurde die Verbindung als „Sialinsäure“ bezeichnet (sialos = griech. Speichel,)⁵.

1941 isolierte Klenk aus Gangliosiden unabhängig von Blix eine ähnliche Substanz und nannte sie „Neuraminsäure“⁶. 1951 gelang Gottschalk die Gewinnung der Stammsubstanz, der N -Acetylneuraminsäure (Neu5Ac, 1)7. Daraufhin haben Kuhn und Brossmer 1962 die molekulare Struktur der Neu5Ac aufgeklärt⁷.

Unter dem Begriff Sialinsäuren werden zurzeit mehr als 40 Derivate der Neuraminsäure (5-Amino-3,5-dideoxy- D -glycero-ß-D-galakto-2-nonulosonsäure) zusammengefasst. Die Neuraminsäure ist chemisch gesehen ein saurer Aminozucker und besitzt ein Gerüst aus neun Kohlenstoffatomen. Die Verbindung ist in der Natur nur in substituierter Form vorhanden. Die einfachste und am häufigsten vorkommende Form der Sialinsäuren ist die N -Acetylneuraminsäure, (Neu5Ac1)⁷.

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Abb. 2: Neu5Ac

Viele in der Natur gefundene Derivate lassen sich von Neu5Ac ableiten. Die bekanntesten Derivate sind N -Glycolylneuraminsäure, Neu5Gc (2) und die Ketodesoxynonulonsäure, KDN (3)⁸.

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Abb. 3: Neu5Gc (2) und KDN (3)

Sialinsäuren bilden in Lösung eine Pyranose-Ringstruktur mit einer²C₅-Sesselkonformation aus und kommen in natürlichen Glycokonjugaten ausschließlich in der a-Konfiguration vor9. Man findet beispielsweise Sialinsäuren a-2,3- oder a-2,6-glycosidisch verknüpft an Galaktose, N -Acetylglucosamin oder a-2,8 an eine zweite Sialinsäure gebunden.

Die meisten anderen Sialinsäuren entstehen durch Substitution einer oder mehrerer Hydroxylgruppen von Neu5Ac, Neu5Gc oder KDN mit Acetyl-, Methyl-, Lactyl-, Phosphat-oder Sulfatgruppen. Sulfat- und Methylgruppen werden nur in C-8-Position gefunden. Acetylgruppen sind in C-4-,7-,8- oder 9-Stellung lokalisiert. Freie Neu5Ac-Moleküle liegen in natürlichen Geweben nur in geringen Mengen vor¹⁰.

2.2 Vorkommen der Sialinsäuren

Sialinsäuren konnten im Tierreich von Echinodermaten bis zum Menschen nachgewiesen werden¹¹. Wirbeltiere besitzen in der Regel O -acetylierte Sialinsäuren.

Tab. 1: Übersicht über natürlich vorkommende O -acetylierte Sialinsäuren

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Humanes Gewebe enthält nur drei verschiedene Typen von Sialinsäuren, nämlich die Neu5Ac, die Neu5,9Ac2 und die 9- O -Laktat Neu5Ac (Neu5Ac9Lt)12. Außer in den schon oben genannten höheren Tieren und Bakterien wurden Sialinsäuren in niederen Eukaryoten, einigen Pilzen und Protozoen nachgewiesen. In Bakterien kommen Sialinsäuren, im Gegensatz zu Eukaryoten, weniger als terminale, sondern in der Regel als interne Zuckereinheiten der Polysaccharide oder Polysialinsäuren vor. Sie bilden Komponenten der Polysaccharide der äußeren Bakterienhülle und dienen als Schutzbarriere vor der Bekämpfung durch das Immunsystem der Wirtsorganismen.

Sialinsäuren wurden bis heute im Pflanzenreich und in Hefen noch nicht gefunden¹³.

2.3 Biosynthese der Sialinsäuren und ihre biologische Bedeutung

Obwohl die Sialinsäuren in der Natur stark verbreitet und viele unterschiedliche Modifikationen aufweisen, geht man trotz vieler Unklarheiten davon aus, dass ihnen allen eine gemeinsame Biosynthese zu Grunde liegt. Der Biosyntheseweg der Sialinsäure in Eukaryoten ist in Abbildung 4 dargestellt¹⁴.

Das N -Acetylmannosamin wird in vivo entweder aus UDP- N -acetylglucosamin via UDPGlc N Ac-Epimerase oder aus Glc N Ac durch Katalyse von Glc N Ac-2-Epimerase erhalten. Dieses Molekül ist als der Precurser der Biosynthese. Die Man N Ac-6-Kinase katalysiert, unter Verbrauch von ATP als Energielieferant, zuerst die Phosphorylierung der C-6-Position. Das Produkt dieser Reaktion wird anschließend von einer spezifischen Synthase mit PEP unter Freisetzung von anorganischem Phosphat zur 9-Phospho-Neuraminsäure kondensiert. Durch Dephosphorylierung mit einer spezifischen Phosphatase kann die freie Neuraminsäure erhalten werden. Die synthetisierte Neuraminsäure muss für die weitere Verwendung zuerst aktiviert werden.

Die Aktivierung erfolgt mit Hilfe der CMP-Neu5Ac-Synthase unter Verbrauch von CTP im Nukleus. Der aktivierte Zucker wird anschließend zum Golgi-Apparat transportiert, wo er durch eine spezifische Sialyltransferase auf ein Glycan übertragen wird. Über weitere zelluläre Prozesse wird das entsprechende sialylierte Glucoprotein oder Glukolipid in die Zellmembran eingebaut.

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Abb. 4: Biosynthese von Neu5Ac (1) in Eukaryonten¹⁴

In Prokaryoten wird die einzig vorkommende N -Acetylneuraminsäure direkt aus Man N Ac und Phosphoenolpyruvat synthetisiert. Diese Synthese wird durch eine Neu5Ac-Synthase katalysiert. Die so gebildete freie Sialinsäure wird mit einer CMP-Synthetase in die aktivierte Form überführt und auf einen Akzeptor übertragen.

Sialinsäuren haben vielseitige Funktionen in lebenden Organismen. Durch ihre negative Ladung wird die Plasmamembran aufgeladen, was die Struktur, Stabilität und notwendige Permeabilität z. B. für Ionen beeinflusst und gewährleistet. Sialinsäuren können zudem körpereigene, antigene Strukturen maskieren, was eine Autoimmunreaktion verhindert. Es wird vermutet, dass Krebszellen sich auf die gleiche Art und Weise vor dem Immunsystem schützen. Außerdem steuern N -Acetylneuraminsäuren zelluläre Adhäsions-, Aggregations-, oder Agglutionsprozesse und dienen als Rezeptoren für manche Viren (z. B. Grippeviren)¹⁵. Acylneuraminsäuren erhöhen auch die Viskosität von Glykoproteinen in wässriger Lösung, was für die Ausbildung von schleimigen Substanzen der Atemwege, des Verdauungstraktes und der Augenhöhle unentbehrlich ist¹⁶.

2.4 Chemische und enzymatische Synthesen der Sialinsäuren

Das gesteigerte Interesse an Sialinsäuren führte schließlich zur Entwicklung entsprechender chemischer Synthesemethoden. Die erste chemische Neu5Ac-Synthese gelang Conforth schon 1957, bevor die genaue Struktur bekannt war¹⁷.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 5: Neu5Ac-Synthese von Conforth¹⁷

Die Ausbeute der Reaktion betrug nur zwei Prozent.

Kuhn und Baschang verbesserten 1962 die Synthese der Neuraminsäure und erreichten eine Ausbeute von 34 Prozent¹⁸.

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Abb. 6: Neu5Ac-Synthese von Kuhn und Baschang¹⁸

Die erste Totalsynthese der Neu5Ac konnten Danishefsky und De Ninno verwirklichen. Sie brauchten 18 Reaktionen, um N -Acetylneuraminsäure als Racemat zu bekommen. Die dabei erzielte Gesamtausbeute betrug ca. fünf Prozent¹⁹.

Neue Synthesen schlagen andere Wege zum Aufbau des Neuraminsäuregerüstes vor. Hier sind z. B. die Synthesewege von C-9-Grundkörpern interessant, die die Arbeitsgruppe von Schmidt 1990 veröffentlicht hat. Der C-9-Grundkörper wird dabei durch eine Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf aus einem a -Methoxyacrylat und einer α,β -ungesättigten Carbonylverbindung synthetisiert²⁰.

Im Jahre 1992 synthetisierten Shiba mittels Aldolkondensation von D-Glucose und Oxalacetat fünf isomere Ketodesoxynonulonsäurederivate von denen konnte über mehrere Stufen in Neu5Ac umgewandelt werden konnte²¹.

Es ist zu betonen, dass auch bei neuen chemischen Synthesewegen die Ausbeuten nicht ausreichend sind, um Sialinsäuren in größerem Maßstab herzustellen.

Eine mögliche Alternative ist die enzymatische Synthese von Neu5Ac aus N -Acetyl-D-Mannosamin (Man N Ac) und Pyruvat mit Neu5Ac-Aldolase als Katalysator. Kragl et al. haben eine sehr effiziente Methode zur enzymatischen Synthese von Neu5Ac im Enzym-Membran-Reaktor entwickelt²².

Die Synthese wird dabei in zwei nacheinander ablaufenden Schritten durchgeführt.

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Abb. 7: Enzymatische Synthese von Neu5Ac²²

Beim ersten Schritt wird N -Acetylglucosamin in N -Acetylmannosamin von der N -Acetylglucosamin-2-Epimerase umgewandelt. Daraufhin wird die N -Acetylneuraminsäure aus N -Acetylmannosamin und Pyruvat mit Hilfe von N -Acetylneuraminsäure-Aldolase synthetisiert.

Mit Hilfe der Aldolase-katalysierten Aldolreaktion können auch Derivate der Sialinsäure synthetisiert werden. Itzstein und Kong synthetisierten zum ersten Mal das C-7-Azido-Derivat der Sialinsäure²³.

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Abb. 8: Enzymatische Synthese von 7-Azido-7-deoxy-Neu5Ac²³

Kong und Itzstein gelang auch die Synthese von anderen C-7-Derivaten, wie z.B. Acetylderivaten²³.

2.5 Organokatalyse: Prinzipien und Anwendung in der Synthese

Obwohl die enzymatische Synthese der Sialinsäure viel versprechend ist, müssen Enzyme nach wie vor aus lebendigen Organismen isoliert und gereinigt werden. Die Isolierung und Reinigung erweisen sich oft nicht nur als schwierig, sondern auch als teuer. Um diese Probleme zu umgehen werden zurzeit leistungsfähige organokatalytische Aldolreaktionen entwickelt.

Organokatalyse ist ein Verfahren, bei dem kleine, metallfreie organische Verbindungen für die Katalyse eingesetzt werden. Meistens können Reaktionen an der Luft und in wässrigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Die organokatalytischen Katalysatoren sind preiswerter und häufig stabiler als Enzyme. Manche Reagenzien können auch im industriellen Maßstab verwendet werden²⁴. Die bekanntesten Anwendungen der Organokatalyse sind Aldolreaktionen, Diels-Alder-Reaktionen, Mannich-Reaktionen und Michael-Reaktionen. Da die letzten Reaktionen der in dieser Arbeit verwendeten Synthesen Aldolreaktionen darstellen, soll in dieser Übersicht mehr auf die Organokatalyse von Aldolreaktionen eingegangen werden.

Seit der Entdeckung der Hajos-Parrish-Eder-Sauer-Wiechert-Reaktion sind vor allem die Prolin-katalysierten Aldolreaktionen intensiv untersucht worden²⁵.

Ein Beispiel für die intermolekulare Synthese ist eine von B. List beschriebene Prolin-katalysierte Aldolreaktion²⁶. Diese Prolin-katalysierte Aldolreaktion zeichnet sich durch eine hohe Enantioselektivität aus.

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Abb. 9: Prolin-katalysierte Aldolreaktion nach List²⁶

Der postulierte Mechanismus dieser Prolin-katalysierten Aldolreaktion ist in Abbildung 10 dargestellt.

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Abb. 10: Der Mechanismus der Prolin-katalysierten Aldolreaktion²⁶

Bei der ersten Reaktion wird ein Carbinolamin-Intermediat gebildet, das bei dem Verlust von Wasser ins Iminium-Ion und anschließend ins stabilere Enamin übergeht. Das Enamin greift re-facial das andere Aldehydmolekül an, gleichzeitig wird der Aldehyd reduziert. Am Ende des Zyklus reagiert die reduzierte Zwischenstufe mit Wasser, wobei das Aldolprodukt abgespaltet wird²⁶.

Enders und Grondal konnten zeigen, dass die Prolin-katalysierte Aldoladdition auch zum Aufbau von Pentosen geeignet ist²⁷. Dabei wurden hohe Enantiomerenüberschüsse und gute Diastereoselektivitäten erreicht. Diese Beispiele zeigen ein hohes Potenzial von Aminosäure-vermittelten Reaktionen. Es ist auch zu beachten, dass organokatalytische Katalysatoren bei gleichen Ausbeuten eine gute Alternative zu üblichen enzymatisch-katalysierten Reaktionen darstellen. Es ist zu erwarten, dass mit deren Hilfe auch komplizierte Zucker synthetisiert werden können.

3. Zielsetzung und Aufgabenstellung

Die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit lässt sich in drei Arbeitsbereiche unterteilen. Im ersten Teil soll die 6- epi -Sialinsäure 9 synthetisiert werden.

Die chemoenzymatische Synthese sollte dabei von Benzylidenacetal 1 ausgehen. Die Synthese beinhaltet mehrere Schritte, unter anderem Oxidation, Reduktion, Peracetylierung und Entschützung. Das N -Acetylannosamin – Derivat 8 kann chemisch hergestellt werden. Eine anschließende enzymatische Umsetzung vollendet die Synthese.

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Abb. 11: Chemoenzymatische Synthese der 6- epi -Sialinsäure

Im zweiten Teil der Arbeit soll die 7- O -Methylsialinsäure synthetisiert werden.

Die chemoenzymatische Synthese geht ebenfalls von Benzylidenacetal 1 aus. Die Synthese erfolgt dabei in sieben Schritten, wobei zuerst das Azid 3 synthetisiert wird. Die Derivatisierung an Position 7 kann durch Schützung der freien OH - Gruppen und darauf folgende Methylierung erreicht werden. Anschließende Azid-Reduktion und Entschützung sollen die Verbindung 15 liefern. Im nächsten Schritt erfolgt eine enzymatische Umsetzung mit Hilfe von Aldolase.

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Abb. 12: Chemoenzymatische Synthese des Methylderivates der Sialinsäure

Das Benzylidenacetal 1 kann anhand der von Patroni und Stick publizierten Synthese aus Glucose dargestellt werden²⁸. Die Strategie der Synthese in beiden Teilen der Arbeit kann folgenderweise dargestellt werden:

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Abb. 13: Strategie der Synthese von Derivaten der Sialinsäure

Die Verbindung 3 ist ein Schlüsselmolekül und bietet die Möglichkeit sowohl Position 6 als auch 7 zu verändern. Im dritten Teil der Arbeit soll ein organokatalytischer Ansatz zur Synthese von N -Acetylneuraminsäure untersucht werden.

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Abb. 14: Organokatalytische Synthese der Sialinsäure

Es soll geprüft werden, ob L- bzw. D - Prolin für die Reaktion ein geeigneter Katalysator ist.

4. Beschreibung und Diskussion der Ergebnisse

4.1 Synthesestrategie zur Darstellung der 6- epi-Sialinsäure

Die unten dargestellte Synthesestrategie geht von dem Benzylidenacetal 1 aus. Daraus soll aus dem manno -konfigurierten Azid 3 ein vollständig reduziertes Azid 5 und schließlich das vollständig acetylierte N -Acetylmannosamin 7 hergestellt werden, die nach der Entschützung enzymatisch mit Pyruvat umgesetzt werden soll.

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Abb. 15: Reagenzien und Bedingungen: a) Tf₂O, abs. Pyridin, abs. DCM, -20 °C, 3 h; b) NaN₃, 15 – Krone – 5, abs. DMF, 50 °C, 23 h, 70 %; c) abs. DCM, DMP, von 0°C auf RT; über Nacht, quantitativ; d) NaBH₄, EtOH/THF (2:1), von 0°C auf RT, über Nacht, quantitativ; e) Ac₂O/Pyridin, 5 h, RT; f) Ac₂O/H₂SO₄, von 0°C auf RT, über Nacht, 3 %; i) abs. MeOH, frisches MeO^- Na⁺, 3 h, quantitativ; h) Wasser, Pyruvatlösung, Aldolase, pH = 7; 37 °C;

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