Inhaltsverzeichnis

1  Einleitung  6

2  Theoretischer Teil  7

2.1  Entdeckung und Struktur der Sialinsäuren  7

2.2  Vorkommen der Sialinsäuren  8

2.3  Biosynthese der Sialinsäuren und ihre biologische Bedeutung  9

2.4  Chemische und enzymatische Synthesen der Sialinsäuren  10

2.5  Organokatalyse: Prinzipien und Anwendung in der Synthese  12

3  Zielsetzung und Aufgabenstellung  14

4  Beschreibung und Diskussion der Ergebnisse  16

4.1  Synthesestrategie zur Darstellung der 6-epi-Sialinsäure  16

4.2  Versuche zur Darstellung von 6-epi-Sialinsäure  17

4.3  Synthesestrategie zur Darstellung des 7-O-Methylsialinsäure  20

4.4  Synthese zur 7-O-Methylsialinsäure  21

4.5  Darstellung von N-Acetylneuraminsäure und N-Acetylneuraminsäure-  

methylester  mit Hilfe der Prolin-katalysierten Aldolreaktion  23

5  Zusammenfassung und Ausblick der Synthese  27

6  Experimenteller Teil  32

6.1  Allgemeines  32

6.2  Darstellung der Verbindungen aus Kapitel 4.2  34

6.3  Darstellung der Verbindungen aus Kapitel 4.4  39

6.4  Darstellung der Verbindungen aus Kapitel 4.5  45

7  Abkürzungsverzeichnis  52

8  Literaturverzeichnis  53

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1. Einleitung

Alle lebenden Zellen von Archaea bis Eukaryoten sind von einer Membran umgeben. Zellmembranen sind sehr komplex aufgebaut, elastisch verformbar und stellen nicht nur eine selektive Barriere gegen die Außenwelt dar, sondern erfüllen gleichzeitig unterschiedliche Aufgaben ¹ . Hierher gehören unter Anderem zahlreiche Stoffwechselreaktionen, aktiver Transport von unterschiedlichen chemischen Substanzen und Ionen durch die Kanäle, Energieumwandlungsreaktionen wie Photosynthese und oxidative Phosphorylierung. Außerdem enthalten sie Oberflächenrezeptoren, die vor allem für die Weiterleitung und Verstärkung der Signale verantwortlich sind.

Entsprechend der gegenwärtigen Theorie wird die Biomembran als Fließmembran-Modell dargestellt.

Laut dieser Theorie besteht die Membran aus einer doppelten Schicht Lipide und zahlreichen eingebauten Proteinen. An manche Proteine sind unterschiedliche Kohlenhydratreste angelagert. Diese Proteine werden als Glukoproteine bezeichnet ² .

Die Erkenntnisse, dass die physiologische Bedeutung der Kohlenhydrate über die bekannten Funktionen als Energiequelle (Glukose), als Energiespeicher (Glykogen) und als Gerüstsubstanzen (Zellulose) hinausgeht, setzten neue Akzente in der Biologie. Kohlenhydratanteile verleihen sowohl körpereigenen als auch körperfremden Zellen eine ausgeprägte Fähigkeit einander zu erkennen. Die Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglichen unter Anderem z.B. die Differenzierung von Zellen und Gewebetypen ⁴ . Als endständige Komponente von Glucoproteinen sind häufig N-Acetylneuraminsäuren (auch Sialinsäuren genannt) zu finden.

Wegen ihrer Position werden Sialinsäuren bedeutende biologische Rollen zugeschrieben.

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2. Theoretischer Teil

2.1 Entdeckung und Struktur der Sialinsäuren

Die Sialinsäuren sind sehr komplexe, natürlich vorkommende Einzelzucker mit relativ kurzer wissenschaftlicher Geschichte. 1927 erhielten Walz sowie Levene und Landsteiner den ersten Hinweis auf die Existenz der Sialinsäuren, als sie Glykolipide mit Orcin in eisenchloridhaltiger Salzsäure erhitzten und eine rotviolette Färbung beobachteten. Diese Substanz wurde erstmals von Blix im Jahre 1936 aus Rindersubmaxillarismucin, einem Glucoprotein der Unterkieferspeicheldrüse, isoliert. Wegen der Abstammung wurde die Verbindung als „Sialinsäure“ bezeichnet (sialos = griech. Speichel,) ⁵ . 1941 isolierte Klenk aus Gangliosiden unabhängig von Blix eine ähnliche Substanz und nannte sie „Neuraminsäure“ ⁶ . 1951 gelang Gottschalk die Gewinnung der Stammsubstanz, der N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac, 1) ⁷ . Daraufhin haben Kuhn und Brossmer 1962 die molekulare Struktur der Neu5Ac aufgeklärt ⁷ .

Unter dem Begriff Sialinsäuren werden zurzeit mehr als 40 Derivate der Neuraminsäure (5-Amino-3,5-dideoxy-D-glycero-ß-D-galakto-2-nonulosonsäure) zusammengefasst. Die

Neuraminsäure ist chemisch gesehen ein saurer Aminozucker und besitzt ein Gerüst aus neun Kohlenstoffatomen. Die Verbindung ist in der Natur nur in substituierter Form vorhanden. Die einfachste und am häufigsten vorkommende Form der Sialinsäuren ist die N- Acetylneuraminsäure,(Neu5Ac 1) ⁷ .

Abb. 2: Neu5Ac

Viele in der Natur gefundene Derivate lassen sich von Neu5Ac ableiten. Die bekanntesten Derivate sind N-Glycolylneuraminsäure, Neu5Gc (2) und die Ketodesoxynonulonsäure, KDN (3) ⁸ .

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Abb. 3: Neu5Gc (2) und KDN (3)

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2.3 Biosynthese der Sialinsäuren und ihre biologische Bedeutung

Obwohl die Sialinsäuren in der Natur stark verbreitet und viele unterschiedliche Modifikationen aufweisen, geht man trotz vieler Unklarheiten davon aus, dass ihnen allen eine gemeinsame Biosynthese zu Grunde liegt. Der Biosyntheseweg der Sialinsäure in Eukaryoten ist in Abbildung 4 dargestellt ¹⁴ .

Das N-Acetylmannosamin wird in vivo entweder aus UDP-N-acetylglucosamin via UDPGlcNAc-Epimerase oder aus GlcNAc durch Katalyse von GlcNAc-2-Epimerase erhalten. Dieses Molekül ist als der Precurser der Biosynthese. Die ManNAc-6-Kinase katalysiert, unter Verbrauch von ATP als Energielieferant, zuerst die Phosphorylierung der C-6-Position. Das Produkt dieser Reaktion wird anschließend von einer spezifischen Synthase mit PEP unter Freisetzung von anorganischem Phosphat zur 9-Phospho-Neuraminsäure kondensiert. Durch Dephosphorylierung mit einer spezifischen Phosphatase kann die freie Neuraminsäure erhalten werden. Die synthetisierte Neuraminsäure muss für die weitere Verwendung zuerst aktiviert werden.

Die Aktivierung erfolgt mit Hilfe der CMP-Neu5Ac-Synthase unter Verbrauch von CTP im Nukleus. Der aktivierte Zucker wird anschließend zum Golgi-Apparat transportiert, wo er durch eine spezifische Sialyltransferase auf ein Glycan übertragen wird. Über weitere zelluläre Prozesse wird das entsprechende sialylierte Glucoprotein oder Glukolipid in die Zellmembran eingebaut.

Abb. 4: Biosynthese von Neu5Ac (1) in Eukaryonten

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In Prokaryoten wird die einzig vorkommende N-Acetylneuraminsäure direkt aus ManNAc und Phosphoenolpyruvat synthetisiert. Diese Synthese wird durch eine Neu5Ac-Synthase katalysiert. Die so gebildete freie Sialinsäure wird mit einer CMP-Synthetase in die aktivierte Form überführt und auf einen Akzeptor übertragen.

Sialinsäuren haben vielseitige Funktionen in lebenden Organismen. Durch ihre negative Ladung wird die Plasmamembran aufgeladen, was die Struktur, Stabilität und notwendige Permeabilität z. B. für Ionen beeinflusst und gewährleistet. Sialinsäuren können zudem körpereigene, antigene Strukturen maskieren, was eine Autoimmunreaktion verhindert. Es wird vermutet, dass Krebszellen sich auf die gleiche Art und Weise vor dem Immunsystem schützen. Außerdem steuern N-Acetylneuraminsäuren zelluläre Adhäsions-, Aggregations-, oder Agglutionsprozesse und dienen als Rezeptoren für manche Viren (z. B. Grippeviren) ¹⁵ . Acylneuraminsäuren erhöhen auch die Viskosität von Glykoproteinen in wässriger Lösung, was für die Ausbildung von schleimigen Substanzen der Atemwege, des Verdauungstraktes und der Augenhöhle unentbehrlich ist ¹⁶ .

2.4 Chemische und enzymatische Synthesen der Sialinsäuren

Das gesteigerte Interesse an Sialinsäuren führte schließlich zur Entwicklung entsprechender chemischer Synthesemethoden. Die erste chemische Neu5Ac-Synthese gelang Conforth schon 1957, bevor die genaue Struktur bekannt war ¹⁷ .

Die Ausbeute der Reaktion betrug nur zwei Prozent.

Kuhn und Baschang verbesserten 1962 die Synthese der Neuraminsäure und erreichten eine Ausbeute von 34 Prozent ¹⁸ .

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Die erste Totalsynthese der Neu5Ac konnten Danishefsky und De Ninno verwirklichen. Sie brauchten 18 Reaktionen, um N-Acetylneuraminsäure als Racemat zu bekommen. Die dabei erzielte Gesamtausbeute betrug ca. fünf Prozent ¹⁹ .

Neue Synthesen schlagen andere Wege zum Aufbau des Neuraminsäuregerüstes vor. Hier sind z. B. die Synthesewege von C-9-Grundkörpern interessant, die die Arbeitsgruppe von Schmidt 1990 veröffentlicht hat. Der C-9-Grundkörper wird dabei durch eine Diels-Alder-Reaktion mit inversem Elektronenbedarf aus einem -Methoxyacrylat und einer - ungesättigtenCarbonylverbindung synthetisiert ²⁰ .

Im Jahre 1992 synthetisierten Shiba mittels Aldolkondensation von D-Glucose und Oxalacetat fünf isomere Ketodesoxynonulonsäurederivate von denen konnte über mehrere Stufen in Neu5Ac umgewandelt werden konnte ²¹ .

Es ist zu betonen, dass auch bei neuen chemischen Synthesewegen die Ausbeuten nicht ausreichend sind, um Sialinsäuren in größerem Maßstab herzustellen.

Eine mögliche Alternative ist die enzymatische Synthese von Neu5Ac aus N-Acetyl-D- Mannosamin(ManNAc) und Pyruvat mit Neu5Ac-Aldolase als Katalysator. Kragl et al. haben eine sehr effiziente Methode zur enzymatischen Synthese von Neu5Ac im Enzym-Membran-Reaktor entwickelt ²² .

Die Synthese wird dabei in zwei nacheinander ablaufenden Schritten durchgeführt.

Beim ersten Schritt wird N-Acetylglucosamin in N-Acetylmannosamin von der N- Acetylglucosamin-2-Epimeraseumgewandelt. Daraufhin wird die N-Acetylneuraminsäure aus N-Acetylmannosamin und Pyruvat mit Hilfe von N-Acetylneuraminsäure-Aldolase synthetisiert.

Mit Hilfe der Aldolase-katalysierten Aldolreaktion können auch Derivate der Sialinsäure synthetisiert werden. Itzstein und Kong synthetisierten zum ersten Mal das C-7-Azido-Derivat der Sialinsäure ²³ .

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