Efecto genotóxico y mutagénico de la desnutrición moderada y grave en reticulocitos y eritrocitos de rata

Índice

Resumen

Resumen en inglés (Abstract)

Abreviaturas

Índice de Figuras

Índice de Cuadros

Índice de Gráficas

1. Introducción
1.1 Desnutrición
1.1.1 Clasificación de la desnutrición
1.1.2 Desnutrición moderada
1.1.3 Desnutrición grave
1.1.4 Epidemiología
1.1.5 Modelos experimentales para inducción experimental de la desnutrición
1.2 Estudios citogenéticos y de desnutrición
1.3 Ensayo de Micronúcleos (MN)
1.3.1 Clasificación de MN
1.3.2 Porcentajes de MN en estudios de la desnutrición
1.4 Estudio a nivel génico: ensayo de mutación somática en el gen (Pig-a)
1.4.1 Proteína CD59
1.4.2 Principio del ensayo Pig-a
1.5 Mutaciones génicas
1.5.1 N-etil-N-nitrosourea (ENU)
1.6 Uso de antibióticos en el manejo de la desnutrición
1.6.1 Trimetoprima y sulfametoxazol (TMP-SMX)

2. Antecedentes
2.1 Estudios citogenéticos y génicos de la desnutrición
2.2 Eritropoyesis.

3. Planteamiento del problema y pregunta de Investigación.

4. Justificación

5. Hipótesis

6. Objetivos

7. Método
7.1 Inducción de desnutrición experimental post-natal
7.2 Desnutrición experimental post-destete
7.3 Administración de ENU
7.3.1 Toma de muestra de sangre periférica
7.4 Administración de TMP-SMX
7.4.1 Toma de muestra de sangre periférica
7.5 Obtención y fijación de la muestra para ensayo de MN.
7.6 Marcaje y procesamiento de muestras..
7.7 Análisis por citometría de flujo
7.8 Selección de la región de análisis..
7.9 Tinción diferencial de diferentes poblaciones de eritrocitos..
7.10 Detección de la mutación Pig-a (marcaje de las muestras)
7.11 Análisis por Citometría de Flujo
7.12 Selección de la región de análisis
7.13 Muestra de calibración (muestra pseudomutante)
7.14 Análisis estadístico de los resultados

8. Resultados
8.1 DN2°: peso corporal
8.2 Efectos de la DN2°
8.2.1 Efecto genotóxico
8.2.1.1 Porcentaje de RET-MN
8.2.1.2 Porcentaje de E-MN
8.2.1.3 Porcentaje de RET
8.2.3 Efecto mutagénico
8.2.3.1 Frecuencia de RET mutantes (RETCD59-)
8.2.3.2 Frecuencia de E mutantes (ECD59-)
8.2.3.3 Porcentaje de RET
8.3 Efectos de la DN3°
8.3.1 DN3°: peso corporal..
8.3.2 Efecto genotóxico
8.3.2.1 Porcentaje de RET-MN..
8.3.2.2 Porcentaje de E-MN...
8.3.2.3 Porcentaje de RET..
8.3.3 Efecto mutagénico
8.3.3.1 Frecuencia de RET mutantes (RETCD59-)
8.3.3.2 Frecuencia de E mutantes (ECD59-)..
8.3.3.3 Porcentaje RET
8.4 Comparación de los porcentajes y las frecuencias basales acumuladas de ratas testigo, DN2° y DN3°

9. Discusión
9.1 Modelo de inducción de desnutrición.
9.2 Efecto genotóxico y mutagénico de la DN2°
9.2.1 Efecto genotóxico
9.2.2. Efecto mutagénico
9.3 Efecto genotóxico y mutagénico de la DN3°
9.3.1 Efecto genotóxico..
9.3.2. Efecto mutagénico
9.4 Susceptibilidad a daño genético en desnutrición
9.5 Ensayos de mutación génica en estudios de desnutrición

10. Conclusiones

11. Perspectivas

12. Referencias Bibliográficas

13. Publicaciones generadas en este trabajo

13.1 Publicaciones generadas de la estancia de Investigación

Resumen

La DN es un padecimiento que daña las funciones celulares de manera progresiva en el organismo. Es la causa del 45 % de las muertes en los niños menores de 5 años de edad, y aunque se han estudiado ampliamente sus efectos a nivel citogenético, a nivel génico no se cuenta con suficientes reportes que muestren si es posible relacionar el grado de DN con la susceptibilidad génica. En el manejo clínico de la DN, los antibióticos forman parte de la mayoría de los protocolos, no obstante, existe poco análisis de los efectos del actual método de tratamiento en los que se emplean diferentes antibióticos de rutina como la TMP- SMX.

En este trabajo se evaluaron los efectos genotóxico y mutagénico del DN2° y del DN3° con la combinación de los ensayos de MN y Pig-a para determinar el daño al ADN en RET y E de ratas BN y con DN2°óDN3° expuestas y no expuestas a ENUóa TMP-SMX. Ratas de la cepa Wistar fueron evaluadas por 63 días después de la exposición a ENU y 45 días después de ser tratadas con TMP-SMX donde se monitorearon los porcentajes de MN y las frecuencias de mutantes Pig-

a.

Los resultados muestran que la DN2° y la DN3° se relacionan con un efecto genotóxico y mutagénico al incrementar el porcentaje de MN y la frecuencia de mutantes Pig-a. Los animales expuestos al ENU presentaron incrementos dosis y tiempo dependientes. Al comparar los efectos inducidos entre estos grupos se observó que no hubo diferencias significativas entre los animales BN y con DN2°. Por otra parte, se encontró un efecto mutagénico persistente con la dosis de 100/500 mg TPM-SMX y DN3°. El DN3° tiene mayor efecto genotóxico en comparación con el efecto producido por la DN2°. No se observaron diferencias en el efecto mutagénico relacionado con el grado de DN. De acuerdo a los resultados obtenidos, es necesario continuar con estudios complementarios en ambos grados de DN que fortalezcan los hallazgos obtenidos en este estudio.

Abstract

UN is a condition that damages the cellular functions of the body progressive way. Is the cause of 45% of global deaths in children under 5 years of age; It has been widely studied the effects at cytogenetic level, however for gene level not have enough reports to show if it is possible to relate the UN degree and susceptibility gene.

In managing the UN, antibiotics are part of most protocols, however, there is not enough analysis regarding the evidence behind the current treatment method of different routine antibiotics such as TMP-SMX.

In this report, genotoxic and mutagenic effects of UN2° and UN3° were evaluated with the combination of MN and Pig-a assays to determine DNA damage in RET and RBC in WN rats and UN rats with UN2° or UN3° exposed and not exposed to ENU and TMP-SMX. Wistar rats were evaluated for 65 days after ENU exposed and 45 days after treatment with TMP-SMX, MN index and Pig-a mutant frequencies were monitored.

Results show that UN2° and UN3° are relate to genotoxic and mutagenic effect by increasing the MN index and Pig-a mutant frequency. Animals exposed to mutagen, showed dose-dependent increases for ENU, there were not significant differences between UN2° and WN rats. A persistent mutagenic effect was found with the doses 100/500 mg TPM-SMX and UN3°. The UN3° has high genotoxic effect compared to the effect produced by the UN2°. We did not find differences between mutagenic effect related to UN degree. According to the results, it is necessary to continue with complementary studies in order to evaluate both UN degrees to strengthen the findings found in this study.

Índice de Abreviaturas

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Índice de Figuras

Figura 1. Estructura de la molécula

Figura 2. Célula normal y célula mutante Pig-a

Figura 3. Eritropoyesis normal y formación de mutantes Pig-a en sangre Periférica de rata

Figura 4. Estrategia de selección de las regiones para el análisis de los MN

Figura 5. Selección y tinción diferencial de poblaciones con MN

Figura 6. Estrategia de selección de las regiones de análisis de mutantes Pig-a

Figura 7. Instrumento de calibración

Índice de Cuadros

Cuadro 1. Aductos del ADN después de la exposición a ENU

CCuadro 2. Grupos de estudio de ratas BN y con DN2° expuestos a ENU

Cuadro 3. Grupos de estudio de ratas BN y con DN3° tratados con TMP-SMX

Cuadro 4. Peso de las ratas BN y DN2° expuestas y no expuestas a ENU

Cuadro 5. Peso de las ratas BN y DN3° expuestas y no expuestas a TMP-SMX.

Índice de Gr á ficas

Gráfica 1. Porcentaje de RET-MN en sangre periférica de ratas BN

y con DN2° expuestas y no expuestas a dos dosis de ENU

Gráfica 2. Porcentaje de E-MN en sangre periférica de ratas BN y con DN2° expuestas y no expuestas a dos dosis de ENU

Gráfica 3. Porcentaje de RET en sangre periférica de ratas BN y con DN2° expuestas y no expuestas a dos dosis de ENU

Gráfica 4. Frecuencia de RETCD 59 - en ratas DN2° y BN testigo y expuestas a ENU

Gráfica 5. Frecuencia de ECD 59 - en ratas DN2° y BN testigo

y expuestas a ENU

Gráfica 6. Porcentaje RET en las ratas con DN2° y BN expuestas a ENU con base al testigo

Gráfica 7. Porcentaje RET-MN en sangre periférica de ratas BN y con DN 3° testigo y expuestas y no expuestas a dos dosis de TMP-SMX

Gráfica 8 Porcentaje de E-MN en sangre periférica de ratas BN y con DN 3° testigo y expuestas y no expuestas a dos dosis de TMP-SMX

Gráfica 9. Porcentaje de RET en sangre periférica de ratas BN y con DN 3° testigo y expuestas y no expuestas a dos dosis de TMP-SMX

Gráfica 10. Frecuencia de RETCD 59 - en sangre periférica de ratas BN y con DN 3° testigo y expuestas y no expuestas a dos dosis de TMP-SMX

Gráfica 11. Frecuencia de ECD 59 - en sangre periférica de ratas BN y con DN 3° testigo y expuestas y no expuestas a dos dosis de TMP-SMX

Gráfica 12. Porcentaje de RET en sangre periférica de ratas BN expuestas y no expuestas a dos dosis de TMP-SMX

Gráfica 13. Porcentajes basales de ensayo de MN en sangre periférica de ratas con DN2° y DN3°

Gráfica 14. Frecuencias basales de ensayo Pig-a en sangre periférica de ratas con DN2° y DN3°

1. Introducción

1.1 Desnutrición

La DN es un problema de salud pública que afecta principalmente a la población menor de 5 años; se presenta como un síndrome nutricional caracterizado por la asimilación deficiente de alimentos. La DN es considerada como un estado multifactorial donde predomina el déficit energético y proteico, resultado del desbalance negativo de la cantidad y calidad de macro y micronutrientes necesarios para proveer energía suficiente al organismo para su desarrollo apropiado (Gómez, 1946; Rodríguez et al., 2011; Kumar et al., 2015).

La deficiencia de macronutrientes como las proteínas, carbohidratos y lípidos, provoca DCP y combinada con la deficiencia de micronutrientes útiles para la síntesis de enzimas y de proteínas, altera la formación de sustratos necesarios para la biotransformación e inactivación de sustancias tóxicas para el organismo lo que representa un problema nutricional que afecta a millones de mujeres embarazadas, ancianos y niños (González-Mendoza et al., 2002; Rodríguez et al., 2011). Por ejemplo, deficiencias de micronutrientes como el hierro, yodo, folato y ácido fólico, vitamina A y Zinc son las más comunes y propician estadios pobres de crecimiento y madurez biológica e incrementan el riesgo de morbilidad y mortalidad (Bailey et al., 2015). La deficiencia en hierro desencadena anemia microcítica, altera el sistema inmune y endócrino (Lozoff et al., 2013), mientras que, la deficiencia de yodo puede afectar la función de la glándula tiroides (Bailey et al., 2015). El zinc está implicado en múltiples aspectos del metabolismo celular (es necesario para la actividad de más de 200 enzimas), además de que juega un papel crítico para la función del sistema inmunológico, la división celular y la síntesis de ácido desoxirribonucleico (ADN) (Bailey et al., 2015). El folato es un término genérico para varias formas de la vitamina B. El folato se encuentra naturalmente en los alimentos, mientras que el ácido fólico es una forma sintética de la vitamina que se utiliza en los alimentos enriquecidos y en suplementos dietéticos. El ácido fólico es esencial para la síntesis de purinas y timidilato y, por lo tanto, está implicado en la síntesis, la estabilidad, y la reparación del ADN (McLean et al., 2008; Bailey et al., 2015). Por su parte, la deficiencia de vitamina A ha sido asociada con un aumento en el riesgo y la severidad de las infecciones, además de ser una de las causas principales de morbilidad y mortalidad infantil en los países en desarrollo mundo (Bailey et al., 2015).

La DN es un padecimiento que daña las funciones celulares de manera progresiva, afecta la capacidad de respuesta al estrés, el metabolismo energético, los mecanismos de comunicación y de regulación celular, por lo que, de no controlarse a tiempo, puede provocar la muerte (Calzada, 1998). Los estudios sobre DN en humanos son indispensables, sin embargo, hay protocolos que bioéticamente no pueden ser implementados en humanos (Ortiz et al., 2011), especialmente cuando se trata de mutágenos y fármacos de los cuales no se tiene suficiente información de su potencial efecto genotóxico y mutagénico. Por este motivo, se proponen modelos de estudio empleando animales de experimentación, donde además de poder controlar diversas variables, se pueden evaluar los posibles efectos de daño al ADN.

1.1.1 Clasificación de la desnutrición

Gómez (1946) hizo una descripción de la DN y con base en diferentes indicadores como el déficit de peso, de talla y la relación peso/talla con respecto a lo esperado para la edad cronológica del organismo, la clasificó en tres grados:

Desnutrición de primer grado o leve (DN1°): déficit de peso entre el 10 y 24%. Desnutrición de segundo grado o moderada (DN2°): déficit de peso entre el 25 y 39%.

Desnutrición de tercer grado o grave (DN3°): déficit de peso mayor al 40%.

En el DN3º el organismo ha agotado en gran medida las reservas para su sobrevivencia y este tipo de DN también es llamada DCP (Cravioto y VegaFranco, 1995; Ortiz et al., 1999).

1.1.2 Desnutrición moderada

El DN2º afecta al 11 % de los niños menores de 5 años de edad en todo el mundo. Los niños con DN2° tienen 3 veces mayor probabilidad de riesgo de muerte y enfrentan un mayor riesgo de morbilidad de enfermedades infecciosas asi como retraso físico y dificultades en el desarrollo cognitivo en comparación con los niños bien nutridos (Black et al., 2008; Chang et al., 2013). En este grado de DN, se acentúa gradualmente la pérdida de peso. Po r lo que puede pasar fácilmente a DN3°. Los niños con DN2° presentan hundimiento en los ojos y perdida de masa muscular, sus tejidos pierden turgencia y elasticidad; se presentan trastornos diarreicos y edemas por hipoproteinemia. La atención médica deberá centrarse en medidas dietéticas y terapéuticas con estricta vigilancia, ya que si el niño no es Efecto genotóxico y mutagénico de la DN2 ° y DN3 ° en reticulocitos y eritrocitos de rata atendido de manera adecuada puede desarrollar intolerancia a toda clase y cantidad de alimentos que le sean dados (Gómez et al., 2003). La DN2° tiene mayor prevalencia que la DN3° (Pelletier et al., 1994; Nájera et al., 2001) y afecta el estado inmunológico. Se ha reportado que en este grado de DN existe una reducción significativa en la expresión de marcadores de activación de linfocitos y por consiguiente se presenta una menor capacidad de activación de los linfocitos T (Rodríguez et al., 2005; Cortés et al., 2008). Se han reportado otras alteraciones en el ciclo celular en células de bazo de ratas con DN2°, en donde se ha observado que las proporciones de células en fases S y G2/M están reducidas, hay un acortamiento de G1 y un aumento de la fase S, por lo que este grado de DN además de aumentar el tiempo de la fase de síntesis del ADN, aumenta el tiempo total del ciclo celular (Cortés et al., 2013).

1.1.4 Desnutrición grave

Se estima que anualmente, este grado de DN se presenta en el 35% de las 7.5 millones de muertes en niños menores de 5 años (Black et al., 2008; Chang et al., 2013). El DN3° a su vez, tiene dos manifestaciones clínicas: el marasmo y el kwashiorkor (Gómez, 1946; Golden, 2002). El marasmo generalmente se presenta en los lactantes de entre seis y 18 meses de edad (Casanueva et al., 2008) y es producto de una dieta pobre en proteínas y calorías; se caracteriza por un importante retraso del crecimiento.

El niño con marasmo presenta cuadros de infecciones, diarreas, pérdida de grasa corporal, inflamación estomacal, ojos hundidos, pérdida de peso, cambios en el color del cabello y una apariencia física de inanición severa (Parra et al., 2003).

Por otro lado, kwashiorkor es un término aplicado a un niño cuya ingesta de carbohidratos es variable pero no tiene proteínas en su dieta, generalmente se registra en niños de 1 a 5 años de edad (Behrman et al., 1986; Frenk, 1989; Golden, 2002). Se caracteriza por edema en abdomen y extremidades (Sauerwein et al., 1997; Krawinkel, 2003) además de la presencia de otros síntomas como: cambio en el color del cabello el cual se cae con facilidad al tocarlo, piel deshidratada y descamación (Sauerwein et al., 1997; Vega, 1999).

Se ha descrito una forma mixta de DN3° denotada como marasmo-kwashiorkoróKwashiorkor marasmático donde se manifiesta una combinación de las características clínicas previamente mencionadas. Afecta principalmente a niños de un año de edad, el niño presenta edema, desmedro y emaciación. Puede haber también adelgazamiento del pelo y cambios en la piel, que van acompañadas de infecciones recurrentes (respiratorias y gastrointestinales), que se harán más graves entre mayor sea la pérdida de peso. Este es el padecimiento más crónico y grave (Werner & Bower, 1984; Torun et al., 2002; Rodríguez et al., 2011).

La magnitud del problema de la DN3° varía de un país a otro y en las diferentes áreas geográficas de un mismo país.

1.1.5 Epidemiología

La DN es la causa del 45 % de las muertes globales en niños menores de 5 años de edad. En México entre 1988 y 2012, las prevalencias de los tres grados de DN han tenido disminuciones notables (Rivera et al., 2009). Sin embargo, la DN3°, sigue siendo elevada con 13.6% lo que representa cerca de 1.5 millones de niños menores de 5 años con este padecimiento (ENSANUT, 2012).

En términos generales, la prevalencia de DN3° entre las regiones norte, centro, sur, la Ciudad de México, zonas urbanas y rurales ha sido reportada como heterogénea. Las prevalencias en la población rural en el ámbito nacional se han mantenido al doble que en las de zonas urbanas, y han disminuido con mayor velocidad en las regiones norte y centro comparadas con la región sur, donde se sigue presentando un porcentaje elevado con 27.5% (ENSANUT, 2012).

1.1.6 Modelos experimentales para la inducción experimental de desnutrición

Desde hace algunas décadas, se ha mostrado interés por estudiar los efectos causados por la DN y las posibles secuelas en la salud y el desarrollo posterior del organismo (Chandra, 1996; Ortiz et al., 2006). Los estudios sobre DN en humanos son indispensables, sin embargo, para entender sus efectos en diferentes órganos, este tipo de estudios no son factibles. Por lo anterior, es necesario proponer y realizar estudios en modelos con organismos desnutridos experimentalmente, ya que de esta manera es posible controlar diversas variables y se pueden realizar análisis de susceptibilidad génica, por ejemplo, valorar el tratamiento con fármacos (Cortés, 1997).

Dentro de los estudios realizados sobre DN, los modelos animales han sido ampliamente utilizados desarrollándose principalmente en rata y ratón (Ortiz et al., 1999). Si bien los estudios de sus efectos en diferentes etapas de la vida son relevantes, los estudios durante la lactancia podrían considerarse prioritarios, dada la importancia de este período, el cual, en la rata corresponde a la infancia temprana de los niños (Medina, 2005).

Se han empleado básicamente dos métodos para inducir DN experimental en animales de laboratorio durante la lactancia (Ortiz et al., 1996): Uno de ellos está basado en la deficiente calidad del alimento ingerido, en éste, las crías son alimentadas por una nodriza desnutrida que produce leche de calidad deficiente (Resnick et al., 1982; Marin et al., 1995). El otro método, implica la disminución de la cantidad de la leche disponible para cada cría al establecerse la competencia por el alimento, el método consiste en incrementar el número de crías por nodriza, lo que tiene como consecuencia que la cantidad de alimento que puede ingerir cada una de ellas sea baja (Benedetti et al., 1992; Ortiz et al., 1996).

Los estudios particularmente realizados en rata, han aportado información valiosa con relación a las posibles secuelas producidas en diversos niveles y en diferentes etapas de la vida. Además, los estudios en modelos animales presentan diversas ventajas, como son: mayor control de variables, la posibilidad de realizar estudios in vivo, in vitro o ex vivo, además de permitir utilizar diversos órganos, tejidos y tipos celulares, así como poder determinar la susceptibilidad y el posible efecto sobre la funcionalidad celular (Ortiz et al., 1996).

1.2 Estudios citogenéticos y desnutrición

Diversos grupos de investigación han trabajado durante años con el objetivo de establecer y reportar los daños y efectos producidos por la DN a niveles citogenético y celular (Betancourt y Ortiz, 1991). Los primeros reportes de estudios citogenéticos se realizaron empleando AC en linfocitos provenientes de niños con DCP, donde se demostró que los organismos desnutridos presentan mayor frecuencia de AC (Betancourt y Ortiz, 1991). Posteriormente se evaluaron ICH en cultivos de linfocitos. Si bien, algunos grupos no encontraron diferencias significativas entre los grupos experimentales y los testigos, otros grupos de estudio reportaron diferencias significativas en las frecuencias de ICH de los organismos desnutridos al ser comparados con los bien nutridos (Murthy et al., 1980; Ortiz et al., 1994).

Los ensayos cometa y de MN han sido de gran utilidad y han aportado valiosa información para el entendimiento de los efectos de la DN. Se ha observado que la DN causa daño al ADN, mismo que puede estar asociado con la presencia de infecciones y tratamientos farmacológicos a los que se someten los niños que presentan DN (Betancourt et al., 1995; Ortiz et al., 1997).

En otro estudio realizado en RET de sangre periférica de ratas desnutridas experimentalmente durante la lactancia, se observó que la frecuencia de MN es mayor en las células de ratas desnutridas con relación a la observada en las células de ratas bien nutridas. Estos estudios indican que la DN produce daño celular in vivo y este daño puede producir efectos negativos para el desarrollo del organismo (Ortiz et al., 2004).

1.3 Ensayo de micronúcleos (MN)

El ensayo de MN es un método de medición de inestabilidad génica, también evalúa genotoxicidad de sustancias, exposición aguda y crónica y es una prueba de rutina para identificar agentes cancerígenos (Murli, 2003; Abrevaya et al., 2007).

La formación de los MN o cuerpos de Howell-Jolly ocurre durante la división celular, son estructuras que resultan de rupturas de cromosomas por pérdida de los centrómeros (fragmentos acéntricos), o por la pérdida de cromosomas completos. En ambos casos, los MN son incapaces de desplazarse con el resto de los cromosomas a través del huso mitótico, a los polos del núcleo celular durante la anafase de la división celular (Dertinger et al., 2000; Fenech, 2000; Murli, 2003). Los MN son envueltos por la membrana celular en la telofase, posteriormente asumen la morfología de un núcleo con la excepción de ser más pequeños que el núcleo de la célula (Dertinger et al., 2000; Fenech, 2000).

1.3.1 Clasificación de MN

Los MN pueden ser clasificados con base a su origen, si son generados por el rompimiento de la cadena de ADN por la acción de agentes clastogénicos (clastogenicidad), o por una disfunción del huso mitótico durante la división celular como resultado de la exposición a agentes aneugénicos (aneugenicidad) (Dertinger et al., 2002; Torous et al., 2003). Si se trata de un agente clastogénico, entonces se va originar un MN compuesto de fragmentos cromosómicos debido a:

1) ruptura directa del ADN, 2) replicación sobre un molde de ADN dañado y 3) inhibición de síntesis de ADN (Albertini et al., 2000: Fenech, 2000). Cuando son agentes aneugénicos, el MN se conformará de al menos un cromosoma completo o una cromátida, este se origina por alteraciones en: el huso mitótico, el cinetocoro, el centriolo o el centrosoma (Vanparys et al., 1990; Sullivan et al., 2001; Goshima et al., 2003).

El ensayo de MN ha sido reportado en diferentes tipos celulares como son: células germinales, hepatocitos, linfocitos, células de bazo, exfoliados de células obtenidos de mucosa bucal y bronquios, entre otros. Actualmente para realizar el ensayo de MN en rata, a partir de médula ósea o sangre periférica, los RET son el principal tipo celular (Hayashi et al., 2000; Medina, 2005). La prueba de MN con citometría de flujo es apropiada para estudiar especies que presentan frecuencias basales bajas de RET con MN basales y frecuencias bajas de MN y al permitir realizarla en sangre favorece el uso y seguimiento del mismo animal evitando el sacrificio del mismo para la obtención de la médula ósea (Dertinger et al., 2011a). Esto confiere al ensayo de MN, versatilidad para su aplicación y complementariedad con otras pruebas a nivel génico.

1.3.2 Porcentajes de MN en estudios de desnutrición

Se ha reportado que el porcentaje de MN en linfocitos de niños con DN es mayor comparada con la de los niños bien nutridos (Cervantes et al., 2011). Estudios posteriores evaluaron los porcentajes de MN en RET de sangre periférica de ratas desnutridas experimentalmente durante la lactancia, donde se observó que este indicador de genotóxicidad es alto en las células de ratas desnutridas con relación a la observada en las células de ratas bien nutridas. Estos estudios revelaron que la DN produce daño celular in vivo y este daño puede producir efectos negativos para el desarrollo del organismo (Ortiz et al., 2004).

Se ha reportado que la población de RET en ratas de 21 días de edad con DN3°, disminuye respecto al grupo de ratas bien nutridas y que a su vez, aumenta la frecuencia de RET con MN, en cuanto a los porcentajes de E con MN se reportó mayor frecuencia de éstos en los grupos desnutridos en comparación a los testigos, demostrando así, que en los organismos con DN3° se incrementa la susceptibilidad a daño cromosómico (Medina, 2005).

1.4 Estudio a nivel génico: ensayo de mutación somática en el gen (Pig-a)

La detección de mutaciones somáticas usando al gen “fosfatidilinositol glicano de clase A” (PIG-A en humanos y Pig-a en roedores) se ha propuesto como prueba de rutina para evaluar el potencial mutagénico de agentes químicos. También se ha sugerido que puede ser útil para el estudio de poblaciones humanas expuestas a contaminantes ambientales y en animales de experimentación así como para determinar el riesgo de desarrollar cáncer (Hernández et al., 2008; Dobrovolsky et al., 2010; Peruzzi et al., 2010; Dertinger et al., 2011b).

Pig-a se localiza en el brazo corto del cromosoma X, y codifica para la subunidad catalítica de la enzima 1-6-N-acetilglucosaminiltransferasa que participa en la primera etapa de la biosíntesis de la molécula de anclaje glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Takahaski et al. 1993, Rosee 1997, Tomita 1999, Phonethepswath et al., 2008). En la síntesis de esta ancla participan alrededor de 20 genes diferentes (Kinoshita et al., 1997; Ferguson, 1999), de los cuales Pig-a es el único que se encuentra en el cromosoma X. El gen contiene 6 exones y 5 intrones, el exón 2 es el más grande y en él ocurren la mayoría de las mutaciones, las cuales en general consisten en la inserción de una señal de paro prematura en las instrucciones para sintetizar el GPI, originando una proteína anormalmente pequeña y no funcional (Brodsky, 2008; Genetics Home Reference, 2013).

La molécula de GPI es esencial para el anclaje de una gran variedad de proteínas de la membrana citoplasmática; consta de una molécula de fosfatidilinositol, un núcleo glucano formado por una molécula de N-glucosamina y 3 manosas, y una molécula de fosfoetanolamina (Figura 1) (Phonethepswath et al., 2008;

Hernández et al., 2008; Pacheco et al., 2014).

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Figura 1. Estructura de la molécula GPI. La estructura básica consiste de: fosfatidil inositol (In) unido a tres (a) o a dos colas de ácidos grasos (b) insertados en la membrana citoplásmica, una molécula de glucosamina (GN) , tres manosas (M) y un puente de etanolamina fosforilada (E), la cual sirve de unión para la proteína anclada. En la figura se ilustra la diferencia en la composición de las colas lipídicas unidas al fosfatidilinositol en células nucleadas y eritrocitos de mamíferos (Modificado de Kinoshita, 2008).

1.4.1 Proteína CD59

CD59 es una proteína de 18kD que es dependiente de GPI y ha sido ampliamente usada en el ensayo Pig-a, se expresa en todos los subtipos de leucocitos, en plaquetas y E (Hernández et al., 2008). CD59 también es llamada MIRL (inhibidor de la lisis reactiva de membrana), su función es inhibir la formación del complejo de proteínas que promueve la formación de poros en la membrana que permiten la entrada de fluidos extracelulares, derivando en la muerte de la célula. Debido a su función de inhibidor de este sistema es también llamada protectina (Sugita et al., 1989; Ninomiya y Sims 1992). CD59 también participa en las vías de señalización en linfocitos, se ha reportado que su función consiste en proteger a las células sanguíneas y vasculares contra la lisis mediada por proteínas séricas del complemento; inhibiendo la formación de poros en la membrana, lo cual evita la lisis celular (Sugita et al., 1989).

Los experimentos descritos por Bryce et al., (2008), fueron diseñados para evaluar si la falta de anclajes GPI, especialmente en las moléculas CD59 y CD55, podrían constituir la base de un ensayo de mutación in vivo, especializado en medir, por medio de la citometría de flujo, la frecuencia de mutaciones inducidas. Estos experimentos se realizaron en poblaciones de E de ratas; las frecuencias observadas para los animales expuestos a mutágenos fueron, por lo general, mayores que en los testigos. Estudios posteriores describieron los procedimientos simplificados de manejo de sangre y pruebas de ensayo para el análisis de las frecuencias de mutación presentes en el gen Pig-a (Phonethepswath et al., 2008).

El ensayo de Pig-a ha sido descrito en E y RET de ratón y rata; linfocitos T de rata; en E del mono Rhesus y en granulocitos humanos (Araten et al., 1999; Bryce et al., 2008; Dobrovolsky et al., 2008; Miura et al., 2008a, b; Phonethepswath et al., 2008). La rata ha sido el modelo animal que se ha elegido para el ensayo (Pfuhler et al., 2009).

1.4.2 Principio del ensayo Pig-a

Los estudios en el área de la toxicología genética han generado numerosos procedimientos in vivo e in vitro, para monitorear los efectos que diversos agentes físicos y químicos tienen sobre la integridad genética, así como los posibles riesgos que estos elementos representan para los organismos (Abramsson et al. 2000, Krishna y Hayashi 2000).

El ensayo Pig-a in vivo no requiere el uso de animales transgénicos y requiere de tiempos cortos de procesamiento de la muestra para la obtención de resultados ya que al realizarse por medio de citometría de Flujo, permite interrogar miles de células por minuto. Como ya se mencionó anteriormente, GPI es una molécula cuya función es anclar proteínas, estas proteínas dependientes de GPI aparecen en la superficie celular, y pueden ser detectadas por los anticuerpos apropiados conjugados con fluorocromos (Bryce et al, 2008; Peruzzi et al., 2010).

En una célula con una mutación Pig-a, el ancla GPI no se sintetiza, por lo tanto, las proteínas que requieren este anclaje permanecen o se degradarán en el citoplasma.

Al realizar el análisis por citometría de flujo, el linaje de células puede ser identificado mediante el uso de anticuerpos contra la estirpe de células específicas Efecto genotóxico y mutagénico de la DN2 ° y DN3 ° en reticulocitos y eritrocitos de rata

y de la proteína dependiente de GPI. Las células Pig-a mutantes pueden ser reconocidas por el hecho de que serán negativas cuando se hacen reaccionar con uno o más anticuerpos específicos para proteínas dependientes de GPI. En la Figura 2 se representa una célula normal y una célula mutante Pig-a (Karadimitris y Luzzatto, 2001). La inactivación por mutación de una sola copia del gen, ocasiona la aparición del fenotipo de superficie "GPI-negativo", esto es, la ausencia de las proteínas que necesitan de GPI para unirse a la membrana celular (Peruzzi et al., 2010).

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Figura 2. Célula normal y célula mutante Pig-a. A la izquierda se representa una célula que muestra la expresión de CD59 y GPI. El producto del gen Pig-a es sólo uno de varios genes necesarios para formar GPI, sin embargo, Pig-a es el único que se encuentra en el cromosoma X. A la derecha se observa que un único evento mutacional en el gen Pig-a (cromosoma X) tiene el potencial para interferir con la expresión de la superficie celular de todas las proteínas dependientes de GPI, incluyendo CD59. Este evento es raro, por lo que se ha sugerido que puede ser medido utilizando la citometría de flujo (Modificado de Bryce et al., 2008).

1.5 Mutaciones génicas

Una mutación génica es una alteración permanente en la secuencia del ADN que constituye un gen. Las mutaciones génicas para fines didácticos se clasifican principalmente en dos tipos:

Mutaciones hereditarias: son mutaciones heredadas de los progenitores a los hijos y están presentes durante toda la vida de un individuo, estas mutaciones también se denominan mutaciones de línea germinal, ya que están presentes en las células germinales de los progenitores.

Mutaciones somáticas: son mutaciones que se producen en algún momento durante la vida de una persona y pueden ser consecuencia de la exposición a compuestos químicos y/o por factores ambientales como la radiación solar, también son producidas por errores en la replicación del ADN (Genetics Home Reference, 2016).

Pocos son los reportes que se tienen de los efectos de la DN y en la frecuencia de mutaciones asi como su posible relación a favorecer la susceptibilidad génica presente en organismos con DN3°, por lo que no se sabe cómo la DN afecta la frecuencia de mutaciones génicas.

1.5.1 N-etil-N-nitrosourea (ENU)

Los mutágenos son agentes físicos o químicos capaces de inducir un cambio heredable en la secuencia del genoma de los organismos (Griffiths et al., 2000). El material genético es estable; sin embargo, las mutaciones ocurren espontáneamente, con frecuencias muy bajas en las células que aparentemente no están expuestas a agentes mutagénicos externos. La exposición a mutágenos incrementa las mutaciones basales o “de fondo”. Por lo general, la frecuencia de mutación está en proporción directa a la dosis del mutágeno aplicado, aunque en la relación dosis-respuesta pueden presentarse patrones más complejos (De la Rosa y Ruiz, 1997).

ENU es un mutágeno que inicialmente fue usado con una alta eficiencia en fagos T2 tratados (Loveless y Hampton, 1969). Desde entonces ENU ha sido utilizado en una amplia variedad de sistemas de pruebas de mutación como un control positivo de las sustancias de estudio de genotoxicidad y como un medio de inducción de mutaciones nuevas (Shibuya y Morimoto, 1993).

ENU es un agente alquilante que actúa mediante la transferencia de un grupo etilo a los radicales de oxígeno y nitrógeno del ADN (Caignard, 2014). Estudios in vitro e in vivo han identificado los productos del ADN expuesto a ENU, en el Cuadro I se presentan los porcentajes de etilación y productos producidos en las bases púricas y pirimidínicas del ADN (Goth y Rajewsky, 1974; Singer et al., 1981; Pegg, 1983; Zielenska et al., 1988; Singer y Dosanjh, 1990; van Zeeland et al., 1990).

Cuadro I. Aductos en el ADN después de la exposición a ENU.

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Se presenta el porcentaje total de etilación asi como los productos en bases púricas y pirimidínicas del ADN. La etilación se presenta en los radicales de O y N, siendo mayor el porcentaje de etilción en los radicales O (Tomado de Singer y Dosanjh, 1990).

ENU también causa mutaciones de pares de bases al azar (Justice et al., 1999). Durante la replicación del ADN, los pares de bases etiladas provocan un error de identidad y la introducción de mutaciones puntuales. Noveroske et al. (2000) determinaron que el 63% fueron mutaciones puntuales que dieron lugar a cambios en los aminoácidos, 26% causaron un “splicing” (corte y empalme) anormal, 10% dio lugar a un prematuro codón de terminación, y ~1% causaron mutaciones en las que un codón de paro se convirtió a un codón de aminoácido.

1.6 Uso de antibióticos en el manejo de la desnutrición

La DN comúnmente va acompañada de infecciones respiratorias y gastrointestinales (Rodríguez et al., 2011). Desde 1999 las normas de la OMS recomiendan administrar antibióticos de rutina para todos niños con DN3°, la administración de este tipo de fármaco surgió por la necesidad de tratar a los niños con DN3° como pacientes hospitalizados y estas encomiendas se han extendido a un subgrupo de pacientes denominados ambulatorios, que son niños que presentan DN3° sin complicaciones graves y sin infecciones clínicamente evidentes (Alcoba et al., 2013).

Si bien los antibióticos forman parte de la mayoría de los protocolos de manejo de la DN, existe poco análisis respecto a las pruebas detrás del actual método de tratamiento de diferentes antibióticos de rutina como son amoxicilina, metronidazol, ampicilina, gentamicina, trimetoprima y sulfametoxazol (TMP-SMX), en pacientes ambulatorios y graves. Las pruebas que apoyen las recomendaciones actuales de administración de antibióticos para el manejo de la DN3° sin complicaciones no son suficientes. Sin embargo, dado que estos antibióticos tienen efectos secundarios, los costos, riesgos, beneficios y su uso rutinario requieren de pruebas con urgencia para tener un control fiable de los mismos (Alcoba et al., 2013).

1.6.1 Trimetoprima y sulfametoxazol (TMP-SMX)

El TMP-SMX es una combinación ampliamente utilizada en el tratamiento de infecciones bacterianas, cuenta con un amplio espectro de actividad bactericida, facilidad de administración, es de bajo costo y presenta baja incidencia de efectos secundarios (Ortiz et al., 2011).

Si bien, algunos autores reportan que no hay evidencia de que el TMP-SMX produzca deficiencias de folato en personas normales cuando se administra en las dosis recomendadas, en pacientes con deficiencias en ácido fólico, si puede causar megaloblastosis, leucopenia o trombocitopenia. En uso normal, la combinación parece ejercer poca toxicidad siendo alrededor del 75% de los efectos adversos relacionados con la piel, dichos efectos son producidos por las sulfonamidas. Sin embargo, TMP-SMX también ha sido reportado como causante de hasta tres veces el número de reacciones dermatológicas como lo hace sulfisoxazol cuando se administra por sí solo (Gilman et al., 1990).

En ratas tratadas con TMP-SMX en dosis orales de 200-533 y de 88-355 mg/kg de peso corporal se ha demostrado que sulfametoxazol induce malformaciones tales como el paladar hendido (USP DI, 1992). Sin embargo, al administrar por separado dosis de 192 mg/kg de trimetoprima y 512 mg/kg de sulfametoxazol no inducen el paladar hendido en ratas. La dosis letal reportada para ratón administrada vía oral es de 5513 mg/kg de peso corporal (Budavari: The Merck Index, 1989).

A pesar de ser un antibiótico eficaz, TMP-SMX tiene efectos adversos, así como interacciones fármaco-fármaco importantes, que pueden derivar en el desarrollo de hiperpotasemia; otros efectos tóxicos se presentan como anomalías neurológicas, renales y reproductivas, así como disminución de la capacidad de transporte de oxígeno, entre otros efectos hematológicos y síndromes de hipersensibilidad (Ho y Juurlink, 2011). Por ejemplo, el TMP-SMX administrado con otros fármacos como el metotrexato puede aumentar la supresión en la médula ósea, probablemente como un efecto aditivo antifolato (AMA Drug Evaluations, 1991). A pesar de ello, son insuficientes los reportes de los efectos genotóxicos de TMP-SMX. Ortiz et al. (2011) reportan incrementos en la frecuencia de MN cuando combinaron dosis terapéuticas de estos antibióticos en ratas con DN3°.

2. Antecedentes

2.1 Estudios génicos de la desnutrición

La relación entre la DN y el daño genético ha sido ampliamente estudiada en humanos y en modelos animales (Ortiz et al., 2004; Padula y Seoane, 2008; Ortiz et al., 2011). En cuanto a las herramientas de estudio a nivel génico, se reportó al gen de la enzima hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HPRT) en el modelo de rata cepa Wistar con el método de inducción de DN por competencia de alimento durante la lactancia; sin embargo, los resultados no mostraron diferencias significativas entre los grupos desnutridos experimentalmente contra los testigos (Cortés, 1993). Recientemente se ha implementado un método a nivel génico, para estudiar los efectos de la DN tomando como indicador de daño a la frecuencia de mutaciones somáticas en el gen Pig-a en E de sangre periférica de rata, el modelo usado fue el de inducción de DN por competencia de alimento durante la lactancia, en este trabajo se observaron diferencias significativas en la frecuencia de mutaciones somáticas, siendo los grupos desnutridos los que presentaron la mayor frecuencia en comparación con los grupos testigo (Pacheco, 2012).

2.2 Eritropoyesis

La médula ósea es el sitio donde se producen las células sanguíneas. A partir de la célula totipotencial, llamada célula madre hematopoyética o progenitora, se originan todas las células sanguíneas: eritrocitos, leucocitos (que incluyen los distintos linfocitos) y plaquetas (Hayashi et al., 2000). Los E son responsables de realizar la función altamente especializada de transporte de oxígeno, por lo que es esencial para la supervivencia durante la gestación y la vida postnatal (Barminko et al., 2015).

En los roedores la médula ósea y el bazo son los principales tejidos hematopoyéticos, en los cuales se lleva a cabo la eritropoyesis, en éstos las células madre se encuentran en constante proliferación y pasan por fases de diferenciación y maduración para dar origen a las células de la sangre (Hayashi et al., 2000).

Los E son células altamente especializadas, que maduran a partir de los RET que contienen ARN residual. Los RET, a su vez se generan en la médula ósea a partir de los eritroblastos que pasan por una etapa de enucleación. Después de un breve período de tiempo en la médula ósea, los RET se liberan en la circulación, donde se elimina su ARN residual y maduran a E (Kaushansky, 2006). En condiciones homeostáticas, la maduración de RET en roedores tarda de 2 a 3 días, desde su estancia en la médula ósea y su liberación hacia la circulación (Gronowicz y et al., 1984; Wiczling y Krzyzanski, 2008). Los RET se someten a una amplia remodelación de su membrana, cambios de volumen, y eliminación de los orgánulos y ribosomas. Estos procesos de transformación garantizan que las funciones celulares críticas, tales como la producción de hemoglobina, el transporte de oxígeno, y flexibilidad, sean óptimas en los E (Ney, 2011). En 2009 Miura et al., reportaron un esquema que muestra el modelo de eritropoyesis en rata cuando se exponen los organismos a ENU y ejemplifica la formación de mutantes Pig-a y su detección en sangre periférica, en la Figura 3 en el panel A se muestran los tiempos de maduración de la eritropoyesis normal en sangre de rata, en el panel B se presenta la eritropoyesis donde previamente la rata fue expuesta a ENU y como resultado se obtiene la formación de mutantes Pig-a y su circulación en sangre periférica, donde se pueden identificar los fenotipos no mutantes y mutantes en RET y E.

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Figura 3. Eritropoyesis normal y formación de mutantes Pig-a en sangre periférica de rata. Panel A: se muestra el tiempo que tarda la maduración de E. La eritropoyesis normal se representa como la generación de E inmaduros a partir de células madre en la médula ósea (la parte superior izquierda de la figura) y el tránsito de las células (flecha punteada) en la periferia, donde la maduración culmina en E maduros. Panel B: los E derivados de los precursores eritroides o células madre con mutaciones Pig-a se suministran de forma continua de la médula ósea a la sangre periférica. La inducción de mutantes con ENU inicia en las células madre o células progenitoras tempranas, éstas proliferan en la médula ósea y generan RET mutantes (abajo a la izquierda de la figura), que también transitan hacia la sangre periférica (Modificado de Miura et al., 2009).

3. Planteamiento del problema y pregunta de investigación

La DN ha sido estudiada ampliamente a nivel citogenético, sin embargo, en cuanto a nivel génico no se cuenta con suficientes reportes que muestren si es posible relacionar la falta de nutrientes con la susceptibilidad génica. En un trabajo previo se demostró que las ratas desnutridas experimentalmente presentan mayor frecuencia de mutantes Pig-a en E de sangre periférica, de acuerdo con este antecedente es primordial dilucidar si efectivamente la relación de déficit de nutrimentos favorece e incrementa la susceptibilidad génica de individuos en edades tempranas y adulta. Es por ello que en este trabajo se planteó determinar por medio de los ensayos para la detección de genotoxicidad (MN) y mutagénesis (Pig-a), si se presenta esta relación, estudiando los cambios en las frecuencias de mutantes Pig-a y de MN en RET y E obtenidos de ratas con DN2° y DN3°. Con base en la información de ambos ensayos que son complementarios, se pretende dar respuesta a la siguiente interrogante:

¿La DN2° y la DN3° estarán asociadas con la susceptibilidad genotóxica y mutagénica en ratas, tomando como indicadores el ensayo de MN y el ensayo Pig- a ?

[...]